| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-9页 |
| 第一章 前言 | 第9-19页 |
| ·细胞标记与追踪 | 第9-10页 |
| ·Cre-loxP重组系统 | 第10页 |
| ·Flp-frt重组系统 | 第10-11页 |
| ·Frt标签的设计 | 第11-14页 |
| ·慢病毒及Frt-慢病毒载体 | 第12-14页 |
| ·双重组酶瞬时表达载体 | 第14-17页 |
| ·蛋白降解信号肽 | 第14页 |
| ·重组酶基因Cre的断裂 | 第14-15页 |
| ·内部核糖体进入位点(IRES) | 第15页 |
| ·双重组酶瞬时表达载体的设计 | 第15-16页 |
| ·基因瞬时表达验证载体的设计 | 第16-17页 |
| ·基本策略图 | 第17-18页 |
| 英文缩略词表 | 第18-19页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第19-29页 |
| ·主要的实验试剂和材料 | 第19-20页 |
| ·细胞培养试剂与耗材 | 第19页 |
| ·分子生物学实验试剂及耗材 | 第19-20页 |
| ·主要仪器设备 | 第20-21页 |
| ·主要实验方法 | 第21-27页 |
| ·细胞培养 | 第21页 |
| ·慢病毒的制备及滴度检测 | 第21-22页 |
| ·细胞基因组DNA的提取 | 第22-23页 |
| ·分子生物学实验 | 第23-27页 |
| ·引物序列 | 第27-29页 |
| 第三章 实验结果与分析 | 第29-77页 |
| ·构建Frt标签的目的及步骤 | 第29-36页 |
| ·合成 Frt1 及 MCS2 片段 | 第29-30页 |
| ·构建pUC18/Frt1 | 第30-31页 |
| ·构建 pUC18/Frt1/MCS2 | 第31-32页 |
| ·酶切形成Frt2、3 和4 | 第32-33页 |
| ·构建pUC/Frt1-4 | 第33-36页 |
| ·小结 | 第36页 |
| ·构建携带Frt标签的慢病毒载体 | 第36-39页 |
| ·将Frt1-4 片段接入pLenti6/v5/EGFP载体 | 第37-38页 |
| ·慢病毒载体的包装 | 第38-39页 |
| ·小结 | 第39页 |
| ·携带单拷贝Frt标签的293FT细胞株的建立 | 第39-42页 |
| ·收获慢病毒并感染细胞 | 第39-40页 |
| ·检测 293FT/Frt 细胞中 Frt 标签的拷贝数 | 第40-42页 |
| ·小结 | 第42页 |
| ·基因瞬时表达载体的构建与验证 | 第42-52页 |
| ·构建IRES/d2EYFP片段 | 第43-44页 |
| ·构建iCre/IRES/d2EYFP元件 | 第44-45页 |
| ·合成loxP/MCS/loxP序列 | 第45-47页 |
| ·将iCre/IRES/d2EYFP元件插入两个loxP位点之间 | 第47-48页 |
| ·构建d2EYFP瞬时表达载体 | 第48-50页 |
| ·构建d2EGFP瞬时表达载体 | 第50-52页 |
| ·小结 | 第52页 |
| ·双重组酶（iCre/Flp）的瞬时表达载体的构建 | 第52-56页 |
| ·构建IRES/Flp和IRES/d2Flp元件 | 第53-54页 |
| ·构建Flp和d2Flp瞬时表达载体 | 第54-56页 |
| ·小结 | 第56页 |
| ·鉴定EGFP与d2EGFP的特性 | 第56-60页 |
| ·荧光显微镜检测EGFP和d2EGFP的表达 | 第56-59页 |
| ·共聚焦显微镜检测EGFP和d2EGFP的表达 | 第59-60页 |
| ·小结 | 第60页 |
| ·鉴定d2EGFP瞬时表达载体的特性 | 第60-63页 |
| ·荧光显微镜检测d2EGFP的表达 | 第60-62页 |
| ·共聚焦显微镜分析d2EGFP瞬时表达载体的特征 | 第62-63页 |
| ·小结 | 第63页 |
| ·细胞外检测Frt标签的重组 | 第63-66页 |
| ·构建Flp的原核表达载体 | 第63-65页 |
| ·FLP重组酶蛋白的表达及纯化 | 第65页 |
| ·细胞外验证Frt标签的重组 | 第65-66页 |
| ·在细菌中检测Frt标签的重组 | 第66-67页 |
| ·技术路线 | 第66-67页 |
| ·实验结果 | 第67页 |
| ·在真核细胞内检测Frt标签的重组 | 第67-75页 |
| ·技术路线 | 第68页 |
| ·构建pCMV/flp/IRES/Red质粒 | 第68-69页 |
| ·Flp/Red真核表达载体转染293FT/Frt细胞并提细胞基因组 | 第69-70页 |
| ·检测Frt1-4 的重组情况 | 第70-71页 |
| ·Frt标签在真核细胞中的自发重组 | 第71-74页 |
| ·小结 | 第74-75页 |
| ·检测Cre和Flp酶表达载体的功能 | 第75-77页 |
| 第四章 讨论 | 第77-82页 |
| ·Frt标签的构建 | 第77页 |
| ·Frt在细胞外的重组 | 第77-78页 |
| ·Frt在细菌内的重组 | 第78页 |
| ·Frt在293FT细胞内的重组 | 第78-79页 |
| ·产生小分子量 PCR 产物的原因分析 | 第79-80页 |
| ·慢病毒感染细胞时发生同源序列删除效应 | 第79页 |
| ·PCR过程中的重复序列删除效应 | 第79-80页 |
| ·PCR模板污染问题 | 第80页 |
| ·瞬时表达载体的构建、特性研究及应对可能存在的问题的策略 | 第80-81页 |
| ·瞬时表达载体的构建 | 第80页 |
| ·瞬时表达载体的特性 | 第80-81页 |
| ·应对可能存在的问题的策略 | 第81页 |
| ·意义与展望 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-87页 |
| 附录一 试剂配制 | 第87-90页 |
| 附录二 相关载体 | 第90-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 在校期间科研情况 | 第94页 |
| 个人简历 | 第94页 |
