| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 英文缩略词 | 第10-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-31页 |
| 1 引言 | 第15页 |
| 2 线粒体疾病 | 第15-16页 |
| 3 线粒体聋病 | 第16-20页 |
| 3.1 聋病的致病因素 | 第16-17页 |
| 3.2 与非综合征性耳聋相关的线粒体12S rRNA基因突变 | 第17-18页 |
| 3.3 氨基糖苷类药物性耳聋与线粒体12S rRNA基因A1555G突变 | 第18-19页 |
| 3.4 线粒体单体型对mtDNA突变致聋的影响 | 第19-20页 |
| 4 患者特异性iPS细胞模型 | 第20-30页 |
| 4.1 iPS细胞 | 第20-21页 |
| 4.2 患者特异性iPS细胞 | 第21-26页 |
| 4.3 患者特异性iPS细胞作为疾病模型的优势 | 第26-27页 |
| 4.4 患者特异性iPS细胞在线粒体疾病研究中的应用 | 第27-30页 |
| 5 总结 | 第30-31页 |
| 第二章 实验研究 | 第31-84页 |
| 1 引言 | 第31-32页 |
| 2 实验材料 | 第32-38页 |
| 2.1 组织标本和细胞 | 第32页 |
| 2.2 质粒 | 第32页 |
| 2.3 实验试剂及配置 | 第32-37页 |
| 2.3.1 细胞培养液配置 | 第32-35页 |
| 2.3.2 实验试剂配制 | 第35-36页 |
| 2.3.3 实验试剂 | 第36-37页 |
| 2.4 试剂盒 | 第37页 |
| 2.5 实验仪器 | 第37-38页 |
| 3 实验方法 | 第38-63页 |
| 3.1 尿液细胞的收集和分离 | 第38-39页 |
| 3.1.1 尿液样本的采集 | 第38页 |
| 3.1.2 尿液细胞的分离 | 第38-39页 |
| 3.1.3 尿液细胞的传代 | 第39页 |
| 3.1.4 尿液细胞的冻存 | 第39页 |
| 3.2 CF-1孕鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 | 第39-42页 |
| 3.2.1 CF-1孕鼠胚胎成纤维细胞的分离 | 第39-40页 |
| 3.2.2 细胞的冻存 | 第40-41页 |
| 3.2.3 饲养层细胞的制备 | 第41-42页 |
| 3.3 逆转录病毒的包装和感染 | 第42-44页 |
| 3.3.1 pMX逆转录病毒载体质粒的转化和抽提 | 第42页 |
| 3.3.2 逆转录病毒的包装 | 第42-43页 |
| 3.3.3 病毒的收集和感染 | 第43页 |
| 3.3.4 感染后细胞的接种 | 第43-44页 |
| 3.4 iPS细胞克隆的挑取、维护与培养 | 第44-47页 |
| 3.4.1 iPS单克隆的挑取 | 第44页 |
| 3.4.2 iPS细胞的有饲养层培养 | 第44-46页 |
| 3.4.2.1 iPS细胞的传代 | 第44-45页 |
| 3.4.2.2 iPS细胞的维护 | 第45页 |
| 3.4.2.3 iPS细胞的冻存 | 第45页 |
| 3.4.2.4 iPS细胞的复苏 | 第45-46页 |
| 3.4.3 iPS细胞的无饲养层培养 | 第46-47页 |
| 3.4.3.1 iPS细胞的传代 | 第46页 |
| 3.4.3.2 iPS细胞的维护 | 第46-47页 |
| 3.4.3.3 iPS细胞的冻存 | 第47页 |
| 3.4.3.4 iPS细胞的复苏 | 第47页 |
| 3.5 iPS细胞的生物学鉴定 | 第47-63页 |
| 3.5.1 碱性磷酸酶检测(AP染色) | 第47-48页 |
| 3.5.2 免疫荧光检测 | 第48-49页 |
| 3.5.3 内源多能性基因和外源编程基因相对表达量的检测 | 第49-52页 |
| 3.5.3.1 细胞收集 | 第49页 |
| 3.5.3.2 RNA提取 | 第49-50页 |
| 3.5.3.3 反转录 | 第50页 |
| 3.5.3.4 荧光定量PCR检测 | 第50-52页 |
| 3.5.4 外源编程基因的插入鉴定 | 第52-53页 |
| 3.5.4.1 DNA提取 | 第52页 |
| 3.5.4.2 PCR反应 | 第52-53页 |
| 3.5.4.3 1%琼脂糖凝胶电泳 | 第53页 |
| 3.5.5 iPS细胞的核型分析 | 第53-54页 |
| 3.5.6 多能性基因(Oct4、Nanog)启动子的甲基化水平检测 | 第54-59页 |
| 3.5.6.1 DNA提取 | 第54页 |
| 3.5.6.2 DNA样品处理 | 第54页 |
| 3.5.6.3 启动子区域的PCR扩增 | 第54-56页 |
| 3.5.6.4 PCR产物的胶回收 | 第56-57页 |
| 3.5.6.5 T载体的连接与转化 | 第57-58页 |
| 3.5.6.6 挑菌与菌落PCR | 第58页 |
| 3.5.6.7 数据处理 | 第58-59页 |
| 3.5.7 体外分化拟胚体 | 第59-60页 |
| 3.5.7.1 拟胚体的培养 | 第59页 |
| 3.5.7.2 多能性基因的表达检测 | 第59-60页 |
| 3.5.8 体内分化畸胎瘤 | 第60-61页 |
| 3.5.9 线粒体DNA A1555G突变的鉴定 | 第61-62页 |
| 3.5.9.1 DNA提取(TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit) | 第61-62页 |
| 3.5.10 线粒体结构的透射电子显微镜观察 | 第62-63页 |
| 4 实验结果与分析 | 第63-80页 |
| 4.1 临床资料 | 第63-65页 |
| 4.2 尿液细胞的收集、分离及培养 | 第65-66页 |
| 4.3 CF-1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 | 第66-67页 |
| 4.4 病毒的包装、收集和滴度测定 | 第67页 |
| 4.5 尿液细胞的逆转录病毒感染 | 第67-68页 |
| 4.6 iPS克隆的形成 | 第68-69页 |
| 4.7 iPS细胞的培养 | 第69-70页 |
| 4.8 碱性磷酸酶染色(AP染色) | 第70页 |
| 4.9 免疫荧光检测结果与分析 | 第70-71页 |
| 4.10 内源多能性基因的表达与分析 | 第71-72页 |
| 4.11 外源编程基因沉默的表达与分析 | 第72-73页 |
| 4.12 外源编程基因的插入鉴定 | 第73页 |
| 4.13 多能性基因(Oct-4,Nanog)启动子的甲基化水平检测 | 第73-74页 |
| 4.14 核型分析 | 第74-75页 |
| 4.15 体外分化拟胚体 | 第75-76页 |
| 4.16 拟胚体中三胚层标记基因的表达 | 第76-77页 |
| 4.17 体内分化畸胎瘤 | 第77-78页 |
| 4.18 畸胎瘤组织的切片观察 | 第78-79页 |
| 4.19 线粒体DNA A1555G突变的分析 | 第79页 |
| 4.20 线粒体结果的透射电子显微镜观察 | 第79-80页 |
| 5 讨论 | 第80-84页 |
| 5.1 建立mtDNA A1555G突变导致的耳聋患者特异性iPS细胞系的意义 | 第80-81页 |
| 5.2 利用尿液细胞作为原代细胞进行重编程的优势 | 第81-82页 |
| 5.3 患者特异性iPS细胞作为疾病模型面临的挑战 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-100页 |
| 作者简历 | 第100页 |
