| 致谢 | 第5-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-41页 |
| 1.1 辅酶再生 | 第15-23页 |
| 1.1.1 全细胞法 | 第16-17页 |
| 1.1.2 光化学法 | 第17-18页 |
| 1.1.3 化学法 | 第18-19页 |
| 1.1.4 电化学法 | 第19-20页 |
| 1.1.5 酶法 | 第20-23页 |
| 1.2 NAD(P)~+依赖型葡萄糖脱氢酶研究进展 | 第23-31页 |
| 1.2.1 葡萄糖脱氢酶的三维结构 | 第24-27页 |
| 1.2.2 葡萄糖脱氢酶的理化性质 | 第27-30页 |
| 1.2.3 葡萄糖脱氢酶的定向进化研究 | 第30-31页 |
| 1.2.4 葡萄糖脱氢酶的应用 | 第31页 |
| 1.3 蛋白质工程 | 第31-39页 |
| 1.3.1 定向进化 | 第32-37页 |
| 1.3.2 理性设计 | 第37-39页 |
| 1.4 选题背景和研究内容 | 第39-41页 |
| 第2章 Lysinibacillus sphaericus G10葡萄糖脱氢酶基因的克隆、表达与性质研究 | 第41-73页 |
| 2.1 材料 | 第42-45页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第42页 |
| 2.1.2 化学试剂和分子生物学试剂 | 第42-43页 |
| 2.1.3 培养基和缓冲液 | 第43-44页 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 | 第44-45页 |
| 2.2 方法 | 第45-58页 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 | 第45页 |
| 2.2.2 L.sphaericus G10葡萄糖脱氢酶基因克隆与测序 | 第45-50页 |
| 2.2.3 感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 2.2.4 葡萄糖脱氢酶全序列扩增 | 第50-51页 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 | 第51-53页 |
| 2.2.6 葡萄糖脱氢酶的诱导表达 | 第53-54页 |
| 2.2.7 亲和层析纯化重组葡萄糖脱氢酶 | 第54页 |
| 2.2.8 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第54-55页 |
| 2.2.9 凝胶过滤层析 | 第55-56页 |
| 2.2.10 蛋白浓度测定 | 第56页 |
| 2.2.11 重组葡萄糖脱氢酶性质的研究 | 第56-58页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第58-71页 |
| 2.3.1 葡萄糖脱氢酶基因的克隆 | 第58-59页 |
| 2.3.2 蛋白序列分析 | 第59-61页 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 | 第61-62页 |
| 2.3.4 重组葡萄糖脱氢酶的诱导表达和纯化 | 第62页 |
| 2.3.5 重组酶的最适反应pH和pH稳定性 | 第62-64页 |
| 2.3.6 重组酶的最适反应温度和温度稳定性 | 第64-65页 |
| 2.3.7 酶的常温操作稳定性和长期保存稳定性 | 第65页 |
| 2.3.8 稳态动力学研究 | 第65-66页 |
| 2.3.9 底物谱 | 第66-67页 |
| 2.3.10 金属离子对重组酶活性的影响 | 第67-68页 |
| 2.3.11 有机溶剂对重组酶稳定性的影响 | 第68-71页 |
| 2.4 本章小结 | 第71-73页 |
| 第3章 葡萄糖脱氢酶耐碱机制的初步探讨 | 第73-88页 |
| 3.1 材料 | 第73-74页 |
| 3.1.1 菌种和质粒 | 第73页 |
| 3.1.2 化学试剂和分子生物学试剂 | 第73-74页 |
| 3.1.3 培养基和缓冲液 | 第74页 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 | 第74页 |
| 3.2 方法 | 第74-78页 |
| 3.2.1 LsGDH的同源建模 | 第74页 |
| 3.2.2 表面静电势分布和静电相互作用计算 | 第74-75页 |
| 3.2.3 疏水相互作用计算 | 第75-76页 |
| 3.2.4 定点突变 | 第76-78页 |
| 3.2.5 突变体表达和纯化 | 第78页 |
| 3.2.6 突变体pH稳定性分析 | 第78页 |
| 3.3 结果和讨论 | 第78-87页 |
| 3.3.1 LsGDH的同源建模及模型评价 | 第78-79页 |
| 3.3.2 蛋白表面静电势分布分析 | 第79-81页 |
| 3.3.3 定点突变 | 第81-82页 |
| 3.3.4 突变体表达和纯化 | 第82页 |
| 3.3.5 pH值对突变体稳定性的影响 | 第82-84页 |
| 3.3.6 pH值对静电相互作用的影响 | 第84-86页 |
| 3.3.7 pH值对疏水相互作用的影响 | 第86-87页 |
| 3.4 本章小结 | 第87-88页 |
| 第4章 基于葡萄糖脱氢酶三维结构的理性设计 | 第88-98页 |
| 4.1 材料 | 第88-89页 |
| 4.1.1 菌种和质粒 | 第88-89页 |
| 4.1.2 化学试剂和分子生物学试剂 | 第89页 |
| 4.1.3 培养基和缓冲液 | 第89页 |
| 4.1.4 主要仪器和设备 | 第89页 |
| 4.2 方法 | 第89-92页 |
| 4.2.1 突变位点的选择 | 第89-90页 |
| 4.2.2 定点突变 | 第90-91页 |
| 4.2.3 突变体表达和纯化 | 第91页 |
| 4.2.4 还原性电泳和非还原性电泳 | 第91页 |
| 4.2.5 自由巯基测定 | 第91-92页 |
| 4.2.6 DS255二硫键形成条件的研究 | 第92页 |
| 4.2.7 T(?)值测定 | 第92页 |
| 4.2.8 DS255动力学分析 | 第92页 |
| 4.3 结果和讨论 | 第92-97页 |
| 4.3.1 定点突变 | 第92页 |
| 4.3.2 突变体表达和纯化 | 第92-93页 |
| 4.3.3 还原性电泳和非还原性电泳 | 第93-95页 |
| 4.3.4 DS255二硫键形成条件的研究 | 第95-96页 |
| 4.3.5 DS255热稳定性分析 | 第96页 |
| 4.3.6 DS255动力学研究 | 第96-97页 |
| 4.4 本章小结 | 第97-98页 |
| 第5章 从土壤宏基因组中一步法克隆葡萄糖脱氢酶全长基因的策略 | 第98-107页 |
| 5.1 材料 | 第99页 |
| 5.1.1 菌种 | 第99页 |
| 5.1.2 化学试剂和分子生物学试剂 | 第99页 |
| 5.1.3 培养基和缓冲液 | 第99页 |
| 5.1.4 主要仪器和设备 | 第99页 |
| 5.2 方法 | 第99-102页 |
| 5.2.1 纯培养物基因组提取方法 | 第99-100页 |
| 5.2.2 土壤宏基因组提取方法 | 第100页 |
| 5.2.3 引物设计和PCR条件 | 第100-102页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第102-105页 |
| 5.3.1 已测序芽孢杆菌基因组中葡萄糖脱氢酶的类型和分布 | 第102-103页 |
| 5.3.2 一步PCR扩增含葡萄糖脱氢酶基因全长的DNA片段 | 第103-105页 |
| 5.3.3 序列阳性率和多样性分析 | 第105页 |
| 5.4 本章小结 | 第105-107页 |
| 第6章 结论与展望 | 第107-111页 |
| 6.1 结论 | 第107-109页 |
| 6.2 展望 | 第109-111页 |
| 参考文献 | 第111-124页 |
| 个人简历 | 第124页 |
