| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 1 绪论 | 第13-31页 |
| 1.1 RNA 干扰技术的研究 | 第13-23页 |
| 1.1.1 RNAi 的研究历史 | 第13-14页 |
| 1.1.2 RNAi 的功能及分子生物学机制 | 第14-15页 |
| 1.1.3 RNAi 的作用特征 | 第15-16页 |
| 1.1.4 RNAi 的设计及筛选 | 第16-17页 |
| 1.1.5 siRNA 的制备 | 第17-19页 |
| 1.1.6 RNA 干扰的生物学意义 | 第19-20页 |
| 1.1.7 RNAi 技术的应用 | 第20-22页 |
| 1.1.8 RNAi 技术的存在的问题和展望 | 第22-23页 |
| 1.2 肿瘤多药耐药研究进展 | 第23-28页 |
| 1.2.1 多药耐药研究机制 | 第23-27页 |
| 1.2.2 肿瘤多药耐药的逆转方法 | 第27-28页 |
| 1.3 本论文的主要研究目的、意义和主要内容 | 第28-31页 |
| 1.3.1 本论文的研究目的及意义 | 第28-29页 |
| 1.3.2 本论文研究的主要内容 | 第29-31页 |
| 2 靶向mrpl 基因shRNA 表达载体构建及鉴定 | 第31-51页 |
| 2.1 实验材料 | 第31-36页 |
| 2.1.1 宿主菌 | 第31页 |
| 2.1.2 质粒载体 | 第31-35页 |
| 2.1.3 载体通用引物 | 第35页 |
| 2.1.4 主要试剂及工具酶 | 第35页 |
| 2.1.5 电泳缓冲液及培养基 | 第35-36页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第36页 |
| 2.2 实验方法 | 第36-46页 |
| 2.2.1 shRNA DNA 模板的设计与退火 | 第36-39页 |
| 2.2.2 重组载体的构建 | 第39-42页 |
| 2.2.3 重组载体的筛选鉴定 | 第42-44页 |
| 2.2.4 重组质粒载体大量提取 | 第44-46页 |
| 2.3 实验结果及分析 | 第46-50页 |
| 2.3.1 质粒经HindⅢ和BamHI 双酶切 | 第46页 |
| 2.3.2 质粒酶切产物的回收 | 第46-47页 |
| 2.3.3 重组载体的菌落PCR | 第47-48页 |
| 2.3.4 重组质粒小量提取 | 第48页 |
| 2.3.5 重组质粒的测序鉴定 | 第48-50页 |
| 2.3.6 重组质粒大提的OD 值检测 | 第50页 |
| 2.4 讨论 | 第50-51页 |
| 3 A549/DDP 细胞的电转染和筛选鉴定 | 第51-67页 |
| 3.1 实验材料 | 第51-53页 |
| 3.1.1 pEGFP-N1 质粒 | 第52页 |
| 3.1.2 细胞株 | 第52页 |
| 3.1.3 主要药品及试剂配置 | 第52-53页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第53页 |
| 3.2 实验方法 | 第53-57页 |
| 3.2.1 A549 和A549/DDP 细胞的培养 | 第53-54页 |
| 3.2.2 A549 细胞和A549/DDP 细胞生长曲线绘制 | 第54页 |
| 3.2.3 电转染A549/DDP 细胞条件的优化 | 第54-55页 |
| 3.2.4 重组质粒的线性化 | 第55页 |
| 3.2.5 线性化重组质粒电转染A549/DDP 细胞 | 第55-56页 |
| 3.2.6 G418 压力筛选阳性克隆 | 第56页 |
| 3.2.7 单克隆细胞的制备 | 第56-57页 |
| 3.2.8 PCR 鉴定转染细胞基因组与重组载体的整合 | 第57页 |
| 3.2.9 流式细胞术筛选转染单克隆细胞 | 第57页 |
| 3.3 结果与分析 | 第57-65页 |
| 3.3.1 A549 细胞与A549/DDP 细胞的培养 | 第57-58页 |
| 3.3.2 细胞的生长曲线 | 第58页 |
| 3.3.3 A549/DDP 细胞电转染条件优化 | 第58-59页 |
| 3.3.4 重组质粒的线性化 | 第59-60页 |
| 3.3.5 G418 杀伤曲线 | 第60页 |
| 3.3.6 G418 筛选阳性克隆 | 第60-63页 |
| 3.3.7 单克隆细胞制备 | 第63页 |
| 3.3.8 PCR 鉴定转染细胞基因组与重组载体的整合 | 第63-64页 |
| 3.3.9 单克隆细胞筛选 | 第64-65页 |
| 3.4 讨论 | 第65-67页 |
| 4 MRP1 基因的沉默效果检测 | 第67-80页 |
| 4.1 实验材料 | 第67-68页 |
| 4.1.1 主要分子生物学试剂 | 第67-68页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第68页 |
| 4.1.3 引物 | 第68页 |
| 4.2 实验方法 | 第68-71页 |
| 4.2.1 实时荧光定量PCR（Real Time fluorescence Q-PCR）检测mrp1 基因表达 | 第68-70页 |
| 4.2.2 流式细胞术检测MRP1 的表达水平 | 第70页 |
| 4.2.3 免疫荧光检测MRP1 的表达水平及定位 | 第70-71页 |
| 4.3 结果与分析 | 第71-77页 |
| 4.3.1 细胞转染前后形态学改变 | 第71页 |
| 4.3.2 实验细胞 MRP-1 mRNA 的变化 | 第71-73页 |
| 4.3.3 流式细胞术检测MRP1 蛋白表达水平 | 第73-75页 |
| 4.3.4 免疫荧光检测MRP1 蛋白表达及定位 | 第75-77页 |
| 4.4 讨论 | 第77-80页 |
| 5 A549/DDP 转染细胞多药耐药逆转效果检测 | 第80-95页 |
| 5.1 实验材料 | 第80-81页 |
| 5.1.1 主要分子生物学试剂 | 第80页 |
| 5.1.2 主要仪器 | 第80-81页 |
| 5.2 实验方法 | 第81-83页 |
| 5.2.1 细胞生长曲线的测定 | 第81页 |
| 5.2.2 MTT 法检测细胞的药物敏感性变化 | 第81页 |
| 5.2.3 荧光显微镜观察细胞经肿瘤药物作用下的凋亡情况 | 第81-82页 |
| 5.2.4 DNA 片段化检测的测定 | 第82页 |
| 5.2.5 细胞周期分析 | 第82-83页 |
| 5.2.6 统计学方法 | 第83页 |
| 5.3 结果与分析 | 第83-93页 |
| 5.3.1 转染单克隆细胞的生长曲线 | 第83页 |
| 5.3.2 各组细胞对抗肿瘤药物的敏感性 | 第83-85页 |
| 5.3.3 荧光显微镜检测细胞经肿瘤药物作用的形态学变化 | 第85-88页 |
| 5.3.4 DNA 片段化检测 Ladder | 第88-89页 |
| 5.3.5 流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率 | 第89-93页 |
| 5.4 讨论 | 第93-95页 |
| 结论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-100页 |
| 附录A 实验图 | 第100-105页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
