| 本研究创新点 | 第5-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 第一章 绪论 | 第14-27页 |
| 1 细胞的能量感受器-单磷酸腺苷激活的蛋白激酶AMPK (AMP ACTIVATED PROTEINKINASE) | 第14-17页 |
| 1.1 AMPK的组成与功能在物种间的保守性 | 第14-15页 |
| 1.2 AMPK的活性调节 | 第15-17页 |
| 2 AMPK参与代谢性调控 | 第17-18页 |
| 3 AMPK参与非代谢性生理调控 | 第18-24页 |
| 3.1 AMPK与细胞自噬 | 第18-19页 |
| 3.2 AMPK与细胞的极性建立和维持 | 第19-20页 |
| 3.3 AMPK与细胞分裂 | 第20-24页 |
| 3.3.1 细胞染色体分离 | 第21页 |
| 3.3.2 细胞胞质分裂 | 第21-24页 |
| 4 AMPK的磷酸化底物发现 | 第24-27页 |
| 4.1 AMPK相互作用蛋白的寻找 | 第24-25页 |
| 4.2 AMPK底物磷酸化位点的鉴定 | 第25-27页 |
| 4.2.1 磷酸化蛋白质组学研究 | 第25页 |
| 4.2.2 定量蛋白质组学研究 | 第25-27页 |
| 第二章 基于蛋白质组学的AMPK磷酸化底物的发现 | 第27-36页 |
| 1 引言 | 第27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-31页 |
| 2.1 细胞培养与处理 | 第27页 |
| 2.2 溶液内酶解 | 第27-28页 |
| 2.3 C18 SEPPAK脱盐柱脱盐 | 第28页 |
| 2.4 稳定同位素双甲基化标记 | 第28页 |
| 2.5 IMAC BEADS的制备 | 第28-29页 |
| 2.6 IMAC富集磷酸化肽段 | 第29页 |
| 2.7 HILIC分离磷酸化肽段 | 第29-30页 |
| 2.8 LC-MS/MS分析及数据处理 | 第30页 |
| 2.9 蛋白免疫印迹 | 第30-31页 |
| 3 实验结果 | 第31-35页 |
| 3.1 AICAR激活AMPK实验条件的建立 | 第31页 |
| 3.2 定量磷酸化蛋白质组学实验方案及系统验证 | 第31-32页 |
| 3.3 定量磷酸化蛋白质组学数据分析 | 第32-35页 |
| 3.3.1 定量磷酸化蛋白质组学数据总览及蛋白聚类分析 | 第32-34页 |
| 3.3.2 AMPK磷酸化底物的筛选与功能分析 | 第34-35页 |
| 4 小结 | 第35-36页 |
| 第三章 AMPK参与调控细胞分裂 | 第36-78页 |
| 1 引言 | 第36页 |
| 2 材料与方法 | 第36-46页 |
| 2.1 引物及sIRNA序列信息表 | 第36-38页 |
| 2.2 化合物及抗体信息 | 第38页 |
| 2.3 质粒构建及点突变 | 第38页 |
| 2.4 DNA与RNA的细胞瞬时转染 | 第38-39页 |
| 2.5 慢病毒的包装与感染及基因稳转细胞系的构建 | 第39页 |
| 2.6 腺病毒扩增与感染 | 第39页 |
| 2.7 细胞系培养 | 第39页 |
| 2.8 小鼠原代成纤维的分离与培养 | 第39-40页 |
| 2.9 细胞周期同步化 | 第40-41页 |
| 2.10 细胞的糖饥饿处理 | 第41页 |
| 2.11 免疫共沉淀 | 第41页 |
| 2.12 原核系统的蛋白表达与纯化 | 第41-42页 |
| 2.13 真核系统的蛋白表达与纯化 | 第42-43页 |
| 2.14 体外激酶实验与放射自显影 | 第43页 |
| 2.15 驱动蛋白ATPASE活性的体外测定 | 第43-44页 |
| 2.16 固定细胞的免疫荧光染色 | 第44页 |
| 2.17 激光共聚焦成像与荧光定量分析 | 第44-45页 |
| 2.18 活细胞成像与图像分析 | 第45页 |
| 2.19 流式细胞周期检测 | 第45页 |
| 2.20 统计学 | 第45-46页 |
| 3 结果 | 第46-71页 |
| 3.1 AMPK参与调控细胞分裂 | 第46-50页 |
| 3.1.1 AMPKα敲低引起细胞有丝分裂指数增加 | 第46页 |
| 3.1.2 AMPKα敲低引起有丝分裂的早期阻滞以及胞质分裂的延长 | 第46页 |
| 3.1.3 AMPKα敲低导致有丝分裂后期纺锤体中间区变短 | 第46-48页 |
| 3.1.4 AMPK的活性与有丝分裂后期纺锤体中间区的长度呈正相关 | 第48-50页 |
| 3.2 AMPKα亚基瞬时直接结合于不同的有丝分裂器 | 第50-52页 |
| 3.2.1 激活的AMPKα亚基(anti-pAMPKα~(Thr172))在有丝分裂不同时期的定位 | 第50-51页 |
| 3.2.2 AMPK三亚基在有丝分裂不同时期的定位 | 第51-52页 |
| 3.3 AMPK磷酸化KIF4A SER801位 | 第52-55页 |
| 3.3.1 AMPKα2亚基与KIF4A在细胞内存在直接相互作用 | 第52-53页 |
| 3.3.2 AMPK体外磷酸化KIF4A Ser801位 | 第53-55页 |
| 3.3.3 AMPK体内磷酸化KIF4A Ser801位 | 第55页 |
| 3.4 AMPK通过磷酸化KIF4A SER801位调控有丝分裂后期纺锤体中间区的长度 | 第55-57页 |
| 3.4.1 AMPK对有丝分裂后期纺锤体中间区长度的调控依赖于K1F4A | 第56页 |
| 3.4.2 AMPK通过磷酸化KIF4A Ser801调控有丝分裂后期纺锤体中间区的长度 | 第56-57页 |
| 3.5 AMPK与AURORA B以相互排它的方式磷酸化调控KIF4A的ATPASE活性 | 第57-61页 |
| 3.5.1 AMPK磷酸化KIF4A增加了其ATPase的活性 | 第57-58页 |
| 3.5.2 Aurora B与AMPK以相互排它的方式分别磷酸化KIF4A Thr799位和Ser801位 | 第58-61页 |
| 3.5.3 Aurora B与AMPK磷酸化对KIF4A ATPase活性的影响 | 第61页 |
| 3.6 AMPK与AURORA B在细胞分裂期竞争性磷酸化调控KIF4A | 第61-66页 |
| 3.6.1 KIF4A细胞周期性的磷酸化调控 | 第61-62页 |
| 3.6.2 AMPK与Aurora B在细胞分裂期竞争性磷酸化调控KIF4A | 第62-66页 |
| 3.7 AMPK与AURORAB共同磷酸化调控KIF4A纺锤体中间区的转位聚积行为 | 第66-69页 |
| 3.7.1 KIF4A的磷酸化影响其细胞分裂后期在纺锤体中间区的募集以及中间区的长度 | 第66-68页 |
| 3.7.2 纺锤体中间区的组装依赖于KIF4A在中间区的聚积 | 第68页 |
| 3.7.3 KIF4A与PRC1的相互作用不依赖于KIF4A的磷酸化 | 第68-69页 |
| 3.8 KIF4A依赖的细胞分裂后期纺锤体中间长度的调控可以响应AMPK活性改变 | 第69-71页 |
| 3.8.1 AMPK通过感应能量状态调节KIF4A的磷酸化状态 | 第69-70页 |
| 3.8.2 AMPK通过竞争性磷酸化KIF4A参与调控细胞分裂后期纺锤体中间的长度 | 第70-71页 |
| 4 讨论 | 第71-73页 |
| 4.1 AMPK功能性参与调控细胞分裂 | 第71-72页 |
| 4.2 KIF4A的竞争性磷酸化调控 | 第72-73页 |
| 4.2.1 KIF4A通过磷酸化调控ATPase活性 | 第72页 |
| 4.2.2 KIF4A的去磷酸化调控 | 第72-73页 |
| 4.3 KIF4A作为染色体结合驱动蛋白的其他功能 | 第73页 |
| 5 小结 | 第73-78页 |
| 第四章 利用氧化石墨烯实现多肽对细胞骨架的标记及细胞有丝分裂的成像追踪 | 第78-90页 |
| 1 引言 | 第78-79页 |
| 2 材料与方法 | 第79-81页 |
| 2.1 多肽荧光探针VAR的设计与细胞骨架标记方案 | 第79-80页 |
| 2.2 氧化石墨烯GO与多肽荧光探针VAR的复合 | 第80页 |
| 2.3 细胞培养与探针标记检测 | 第80-81页 |
| 2.4 细胞成像与荧光定量 | 第81页 |
| 2.5 固定细胞免疫染色与激光共聚焦成像分析 | 第81页 |
| 2.6 复合材料的细胞毒性测试(MTS) | 第81页 |
| 3 结果 | 第81-88页 |
| 3.1 VAR/GO复合物的表征测试 | 第81-82页 |
| 3.2 VAR/GO复合物的“关闭式”生物传感器 | 第82-84页 |
| 3.2.1 GO对VAR-TAMRA的荧光关闭 | 第82-83页 |
| 3.2.2 微管蛋白对VAR/GO复合物的荧光恢复 | 第83-84页 |
| 3.3 VAR/GO复合物标记细胞骨架 | 第84-87页 |
| 3.4 VAR/GO复合物标记有丝分裂期细胞 | 第87-88页 |
| 3.5 VAR/GO复合物的细胞毒性测试 | 第88页 |
| 4 讨论 | 第88-89页 |
| 5 小结 | 第89-90页 |
| 第五章 总结与展望 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-106页 |
| 缩略词对照表 | 第106-108页 |
| 附表 | 第108-123页 |
| 在读期间科研成果 | 第123-124页 |
| 致谢 | 第124页 |
