| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-12页 |
| 缩写表 | 第18-20页 |
| 第一章 绪论 | 第20-30页 |
| 1.1 问题的提出 | 第20页 |
| 1.2 基因工程法制备降血压肽的问题 | 第20-21页 |
| 1.3 基因工程法制备降血压肽的策略 | 第21-26页 |
| 1.3.1 重组蛋白的表达系统 | 第21-24页 |
| 1.3.2 重组蛋白的纯化 | 第24-25页 |
| 1.3.3 重组蛋白切割方式 | 第25-26页 |
| 1.3.4 多肽的分离纯化 | 第26页 |
| 1.3.5 多肽的快速定量 | 第26页 |
| 1.4 本研究的立题依据、意义及内容 | 第26-30页 |
| 1.4.1 立题依据和研究意义 | 第26-27页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第27-30页 |
| 第二章 金枪鱼降血压肽Tuna AI工程菌的构建 | 第30-51页 |
| 2.1 引言 | 第30页 |
| 2.2 试验材料与仪器设备 | 第30-33页 |
| 2.2.1 试验材料与试剂 | 第30-33页 |
| 2.2.2 试验仪器及设备 | 第33页 |
| 2.3 试验方法 | 第33-43页 |
| 2.3.1 软件的设计 | 第33-34页 |
| 2.3.2 Tuna AI的串联表达设计 | 第34-35页 |
| 2.3.3 基因单元的优化和多肽水解(酶解)体系的筛选 | 第35页 |
| 2.3.4 Tuna AI的串联基因的构建 | 第35-37页 |
| 2.3.5 定向递归连接法构建高拷贝多聚体 | 第37-38页 |
| 2.3.6 表达载体的构建、转化和鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.7 质粒的提取 | 第39页 |
| 2.3.8 胶回收 | 第39页 |
| 2.3.9 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第39-40页 |
| 2.3.10 热激法转化大肠杆菌 | 第40页 |
| 2.3.11 菌落PCR | 第40-41页 |
| 2.3.12 琼脂糖凝胶电泳 | 第41-42页 |
| 2.3.13 Tricine-SDS-PAGE电泳 | 第42-43页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第43-49页 |
| 2.4.1 Tuna AI串联基因的软件设计 | 第43-47页 |
| 2.4.2 降血压肽串联基因的构建 | 第47-49页 |
| 2.4.3 工程菌诱导表达 | 第49页 |
| 2.5 本章小结 | 第49-51页 |
| 第三章 工程菌培养条件优化 | 第51-70页 |
| 3.1 引言 | 第51-52页 |
| 3.2 试验材料与仪器设备 | 第52-53页 |
| 3.2.1 试验材料与试剂 | 第52-53页 |
| 3.2.2 试验仪器及设备 | 第53页 |
| 3.3 试验方法 | 第53-60页 |
| 3.3.1 种子液的制备 | 第54页 |
| 3.3.2 工程菌的诱导表达 | 第54页 |
| 3.3.3 超声辅助尿素清洗法纯化包涵体 | 第54-55页 |
| 3.3.4 Ni~(2+)柱亲和法纯化蛋白 | 第55页 |
| 3.3.5 SDS-PAGE电泳 | 第55-56页 |
| 3.3.6 蛋白含量测定 | 第56-57页 |
| 3.3.7 诱导时间和温度对包涵体表达的影响 | 第57页 |
| 3.3.8 最适诱导培养基的选择 | 第57页 |
| 3.3.9 金属离子及其螯合剂对包涵体表达的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.10 氨基酸对包涵体表达的影响 | 第58页 |
| 3.3.11 IPTG诱导后超声处理对包涵体表达的影响 | 第58-60页 |
| 3.4 试验结果与分析 | 第60-68页 |
| 3.4.1 重组蛋白包涵体的纯化 | 第60-61页 |
| 3.4.2 最适诱导时间和温度的选择 | 第61-63页 |
| 3.4.3 最适培养基的选择 | 第63-64页 |
| 3.4.4 金属离子和及其螯合剂对包涵体表达的影响 | 第64-65页 |
| 3.4.5 氨基酸对包涵体表达的影响 | 第65-67页 |
| 3.4.6 诱导后超声处理对包涵体表达的影响 | 第67-68页 |
| 3.5 本章小结 | 第68-70页 |
| 第四章 重组Tuna AI纯化及其活性与安全性评价 | 第70-85页 |
| 4.1 引言 | 第70页 |
| 4.2 试验材料与仪器设备 | 第70-72页 |
| 4.2.1 试验材料与试剂 | 第70-71页 |
| 4.2.2 试验仪器及设备 | 第71-72页 |
| 4.3 试验方法 | 第72-78页 |
| 4.3.1 工程菌的优化条件诱导表达 | 第72页 |
| 4.3.2 降血压肽Tuna AI的制备 | 第72-75页 |
| 4.3.3 降血压肽Tuna AI的组成测定 | 第75页 |
| 4.3.4 降血压肽Tuna AI的ACE抑制活性测定 | 第75-76页 |
| 4.3.5 降血压肽Tuna AI的安全性评价动物试验 | 第76-77页 |
| 4.3.6 热稳定性和酸碱稳定性试验 | 第77-78页 |
| 4.4 试验结果与分析 | 第78-84页 |
| 4.4.1 重组降血压肽Tuna AI的制备结果与鉴定 | 第78-80页 |
| 4.4.2 重组Tuna AI的ACE抑制活性 | 第80-81页 |
| 4.4.3 Tuna AI的热稳定性和酸碱稳定性 | 第81页 |
| 4.4.4 Tuna AI的内毒素炎症反应检测 | 第81-82页 |
| 4.4.5 重组降血压肽Tuna AI的急性毒性分析 | 第82-84页 |
| 4.5 本章小结 | 第84-85页 |
| 第五章 重组Tuna AI降血压效果及其作用机理的探讨 | 第85-100页 |
| 5.1 引言 | 第85页 |
| 5.2 材料与仪器 | 第85-86页 |
| 5.2.1 实验动物 | 第85-86页 |
| 5.2.2 实验仪器 | 第86页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第86页 |
| 5.2.4 主要溶液及试剂配制 | 第86页 |
| 5.3 实验方法 | 第86-89页 |
| 5.3.1 样品处理 | 第86-87页 |
| 5.3.2 实验动物 | 第87页 |
| 5.3.3 分组和给药剂量 | 第87页 |
| 5.3.4 大鼠血压测定 | 第87-88页 |
| 5.3.5 血常规指标和生化指标测测定 | 第88页 |
| 5.3.6 组织ACE的提取 | 第88-89页 |
| 5.3.7 SERCA 2a和内皮素基因的实时定量RT-PCR | 第89页 |
| 5.3.8 数据统计 | 第89页 |
| 5.4 结果和分析 | 第89-98页 |
| 5.4.1 一次性灌胃给药对大鼠血压的影响 | 第89-91页 |
| 5.4.2 长期灌胃给药对大鼠的影响 | 第91-93页 |
| 5.4.3 长期灌胃重组降血压肽对大鼠体重的影响 | 第93-94页 |
| 5.4.4 肝脏、肾脏和心脏组织形态学观察 | 第94-96页 |
| 5.4.5 血常规指标和生化指标测测定 | 第96-97页 |
| 5.4.6 SHR组织的ACE活性测定 | 第97页 |
| 5.4.7 Tuna AI对SERCA 2a和内皮素基因的调节 | 第97-98页 |
| 5.5 本章小结 | 第98-100页 |
| 第六章 降血压肽Tuna AI的ELISA检测方法研究 | 第100-111页 |
| 6.1 引言 | 第100页 |
| 6.2 仪器和试剂 | 第100-102页 |
| 6.2.1 试剂 | 第100-101页 |
| 6.2.2 仪器与设备 | 第101页 |
| 6.2.3 溶液配制 | 第101-102页 |
| 6.2.4 实验动物 | 第102页 |
| 6.3 试验方法 | 第102-106页 |
| 6.3.1 抗原合成及鉴定 | 第102-103页 |
| 6.3.2 多抗血清的制备 | 第103页 |
| 6.3.3 多抗血清效价的测定 | 第103-104页 |
| 6.3.4 多抗血清Sepharose-BSA柱制备 | 第104页 |
| 6.3.5 多抗血清Sepharose-BSA柱纯化 | 第104页 |
| 6.3.6 多克隆抗体的纯化 | 第104页 |
| 6.3.7 抗原和多克隆抗体纯度分析 | 第104页 |
| 6.3.8 抗体效价测定及工作浓度选择 | 第104-105页 |
| 6.3.9 间接竞争ELISA程序 | 第105页 |
| 6.3.10 添加回收率的测定 | 第105-106页 |
| 6.4 结果与分析 | 第106-109页 |
| 6.4.1 TunaAI-BSA蛋白纯度和偶联度分析 | 第106页 |
| 6.4.2 抗体效价测定及工作浓度的确定 | 第106-107页 |
| 6.4.3 多克隆抗体的纯化及纯度分析 | 第107-108页 |
| 6.4.4 间接竞争ELISA标准曲线的建立 | 第108页 |
| 6.4.5 添加回收率的测定 | 第108-109页 |
| 6.5 本章小结 | 第109-111页 |
| 第七章 主要结论和展望 | 第111-115页 |
| 7.1 主要研究结论 | 第111-114页 |
| 7.2 主要创新点 | 第114页 |
| 7.3 研究工作展望 | 第114-115页 |
| 参考文献 | 第115-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 攻读博士学位期间科研成果 | 第125-129页 |
| 1、项目 | 第125页 |
| 2、论文 | 第125-126页 |
| 3、软件著作权 | 第126-127页 |
| 4、专利 | 第127-129页 |
| 附件(程序代码) | 第129-139页 |
