| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第10-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-37页 |
| 1.1 半胱氨酸蛋白酶家族及Calpain3(CAPN3) | 第16-24页 |
| 1.1.1 半胱氨酸蛋白酶家族Calpains | 第16-18页 |
| 1.1.2 CAPN3的发现 | 第18页 |
| 1.1.3 CAPN3蛋白的结构与功能 | 第18-21页 |
| 1.1.4 CAPN3与人类疾病LGMD2A | 第21-24页 |
| 1.2 抑癌因子p53 | 第24-29页 |
| 1.2.1 p53的发现 | 第24-25页 |
| 1.2.2 p53的功能及调控 | 第25-28页 |
| 1.2.3 p53的点突变与癌症 | 第28-29页 |
| 1.3 核仁的结构和功能 | 第29-31页 |
| 1.3.1 核仁的结构 | 第29-30页 |
| 1.3.2 核仁是核糖体合成、加工的场所 | 第30-31页 |
| 1.3.3 核仁的其他功能 | 第31页 |
| 1.4 核仁蛋白Def | 第31-33页 |
| 1.5 斑马鱼作为模式生物的优势 | 第33-36页 |
| 1.5.1 斑马鱼作为模式生物的历程 | 第33-34页 |
| 1.5.2 斑马鱼作为模式生物的优势 | 第34页 |
| 1.5.3 斑马鱼与免疫学研究 | 第34-36页 |
| 1.6 本研究的内容、目的和意义 | 第36-37页 |
| 第二章 材料与方法 | 第37-62页 |
| 2.1 斑马鱼 | 第37-39页 |
| 2.1.1 斑马鱼伦理 | 第37页 |
| 2.1.2 斑马鱼饲养 | 第37页 |
| 2.1.3 斑马鱼的交配及受精卵的收集 | 第37-38页 |
| 2.1.4 斑马鱼品系 | 第38-39页 |
| 2.2 细胞系及细胞操作 | 第39-40页 |
| 2.2.1 本课题所用细胞系 | 第39页 |
| 2.2.2 细胞系培养和冻存 | 第39-40页 |
| 2.2.3 细胞转染 | 第40页 |
| 2.3 抗体 | 第40-41页 |
| 2.4 DNA相关操作方法 | 第41-43页 |
| 2.4.1 基因克隆 | 第41-42页 |
| 2.4.1.1 聚合酶链式反应(PCR) | 第41-42页 |
| 2.4.1.2 点突变或短片段删除 | 第42页 |
| 2.4.1.3 拼接PCR(适用于长片段删除) | 第42页 |
| 2.4.2 PCR及DNA酶切产物的纯化 | 第42页 |
| 2.4.3 酶切与连接 | 第42-43页 |
| 2.4.4 基因组DNA的抽提 | 第43页 |
| 2.5 大肠杆菌操作 | 第43-44页 |
| 2.5.1 菌株 | 第43页 |
| 2.5.2 热激法转化感受态细胞及大肠杆菌培养 | 第43-44页 |
| 2.5.3 菌液冻存 | 第44页 |
| 2.5.4 质粒抽提 | 第44页 |
| 2.5.5 菌落PCR | 第44页 |
| 2.6 蛋白质相关操作 | 第44-51页 |
| 2.6.1 蛋白样品的制备(SDS裂解法) | 第44-45页 |
| 2.6.1.1 斑马鱼胚胎蛋白样品的制备 | 第45页 |
| 2.6.1.2 斑马鱼肝脏、肌肉等组织蛋白样品的制备 | 第45页 |
| 2.6.1.3 细胞总蛋白样品的制备 | 第45页 |
| 2.6.2 蛋白免疫印迹(Western blot) | 第45-47页 |
| 2.6.2.1 SDS-PAGE蛋白胶的配制 | 第45-46页 |
| 2.6.2.2 凝胶电泳和转膜 | 第46页 |
| 2.6.2.3 目的蛋白信号检测 | 第46-47页 |
| 2.6.3 免疫共沉淀(Co-IP) | 第47-48页 |
| 2.6.3.1 外源性免疫共沉淀 | 第47页 |
| 2.6.3.2 内源性免疫共沉淀 | 第47-48页 |
| 2.6.4 GST pull-down实验 | 第48-49页 |
| 2.6.4.1 蛋白的表达 | 第48页 |
| 2.6.4.2 His标签蛋白的纯化 | 第48-49页 |
| 2.6.4.3 GST标签蛋白的纯化 | 第49页 |
| 2.6.4.4 蛋白质体外结合与检测 | 第49页 |
| 2.6.5 抗体免疫荧光染色 | 第49-51页 |
| 2.6.5.1 人类细胞系免疫荧光染色 | 第49-50页 |
| 2.6.5.2 斑马鱼胚胎或组织的冷冻切片及免疫荧光染色 | 第50-51页 |
| 2.7 体外酶活实验 | 第51页 |
| 2.8 真核表达系统表达蛋白及纯化 | 第51页 |
| 2.9 核仁分离 | 第51-53页 |
| 2.9.1 细胞系核仁分离 | 第51-52页 |
| 2.9.2 斑马鱼成鱼肝脏核仁分离 | 第52-53页 |
| 2.10 细胞流式计数分析 | 第53页 |
| 2.10.1 细胞系流式计数分析 | 第53页 |
| 2.10.2 斑马鱼胚胎肝脏细胞流式计数分析 | 第53页 |
| 2.11 mRNA的体外合成 | 第53-54页 |
| 2.12 斑马鱼显微注射 | 第54页 |
| 2.13 斑马鱼胚胎整胚原位杂交(WISH) | 第54-55页 |
| 2.14 蛋白质组学分析 | 第55页 |
| 2.15 TALENs技术构建基因敲除品系斑马鱼 | 第55-56页 |
| 2.16 生物信息学分析 | 第56页 |
| 2.17 本研究所用Morpholino、siRNA及引物序列 | 第56-62页 |
| 第三章 p53是CAPN3的底物 | 第62-70页 |
| 3.1 p53上有两个CAPN3的识别位点 | 第62-63页 |
| 3.2 野生型p53在体外能被CAPN3水解成小片段 | 第63-64页 |
| 3.3 p53~(R175H)对CAPN3不敏感 | 第64-68页 |
| 3.3.1 在体外酶活实验中,p53~(R175H)无法被CAPN3降解 | 第64-65页 |
| 3.3.2 His-CAPN3蛋白的表达 | 第65-66页 |
| 3.3.3 粗蛋白抽提液中His-CAPN3酶活性的检测 | 第66页 |
| 3.3.4 His-CAPN3蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| 3.3.5 p53~(R175H)对纯化后的His-CAPN3不敏感 | 第67-68页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第68-70页 |
| 第四章 Def-CAPN3在核仁中形成蛋白复合体 | 第70-83页 |
| 4.1 核仁分离技术的建立 | 第70-73页 |
| 4.1.1 HepG2细胞核仁分离 | 第71页 |
| 4.1.2 成年斑马鱼肝脏细胞核仁分离 | 第71-73页 |
| 4.2 Def与CAPN3形成蛋白复合体 | 第73-80页 |
| 4.2.1 人hu-Def能够与人CAPN3互作 | 第73-75页 |
| 4.2.2 斑马鱼Def能够与斑马鱼Capn3b互作 | 第75-76页 |
| 4.2.3 人类及斑马鱼Def-CAPN3结合位点的探索 | 第76-79页 |
| 4.2.4 Def-CAPN3还可能结合其他蛋白 | 第79-80页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第80-83页 |
| 第五章 Def通过磷酸化修饰招募CAPN3进入核仁 | 第83-91页 |
| 5.1 Def招募CAPN3进入细胞核仁 | 第83-86页 |
| 5.2 Def的N端磷酸化修饰影响了Def与CAPN3的结合 | 第86-87页 |
| 5.3 Def的N端磷酸化修饰影响了斑马鱼Capn3b进入核仁 | 第87-89页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第89-91页 |
| 第六章 Def-CAPN3-p53降解通路对细胞周期的影响 | 第91-102页 |
| 6.1 在细胞系中敲降hu-Def或CAPN3会引起p53依赖的细胞周期抑制 | 第91-92页 |
| 6.2 Def对肝脏发育的促进作用部分依赖于p53通路 | 第92-97页 |
| 6.3 Def的N端磷酸化能够调控斑马鱼肝脏细胞周期进程 | 第97-100页 |
| 6.4 小结与讨论 | 第100-102页 |
| 第七章 通过核仁蛋白组学寻找Def-CAPN3的靶蛋白 | 第102-120页 |
| 7.1 capn3b基因敲除斑马鱼的表型研究 | 第103-108页 |
| 7.1.1 capn3b基因敲除斑马鱼的鉴定 | 第104-105页 |
| 7.1.2 capn3b基因敲除斑马鱼肝脏细胞核仁内p53增多 | 第105-107页 |
| 7.1.3 p53影响3b~(-/-)突变体幼鱼的存活率 | 第107-108页 |
| 7.2 斑马鱼肝脏核仁蛋白质质谱数据分析 | 第108-112页 |
| 7.2.1 质谱蛋白样品的准备 | 第109页 |
| 7.2.2 质谱数据分析 | 第109-112页 |
| 7.3 Def-CAPN3靶蛋白的鉴定 | 第112-117页 |
| 7.4 小结与讨论 | 第117-120页 |
| 第八章 结论与讨论 | 第120-129页 |
| 8.1 结论 | 第120-122页 |
| 8.2 讨论 | 第122-129页 |
| 8.2.1 CAPN3的核仁定位 | 第122-123页 |
| 8.2.2 Def-CAPN3对细胞周期的调控 | 第123-124页 |
| 8.2.3 Def-CAPN3与肿瘤 | 第124-125页 |
| 8.2.4 建立核仁分离技术的价值 | 第125-127页 |
| 8.2.5 Def-CAPN3靶蛋白的鉴定 | 第127-129页 |
| 参考文献 | 第129-143页 |
| 作者简介 | 第143-144页 |
| 致谢 | 第144-145页 |
