脱乙酰基酯酶的重组表达、固定化及其性能研究
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第一章 综述 | 第11-22页 |
| 1.1 头孢类抗生素及D-7-ACA | 第11-12页 |
| 1.1.1 头孢菌素类抗生素 | 第11-12页 |
| 1.1.2 新型医药中间体D-7-ACA及其制备 | 第12页 |
| 1.2 脱乙酰基酯酶的简介 | 第12-14页 |
| 1.2.1 酯酶概述与定义 | 第12-13页 |
| 1.2.2 脱乙酰基酯酶来源与催化机制 | 第13页 |
| 1.2.3 枯草芽孢杆菌脱乙酰基酯酶 | 第13-14页 |
| 1.3 外源基因在大肠杆菌中的高效表达 | 第14-16页 |
| 1.4 发酵过程的优化 | 第16-18页 |
| 1.4.1 分子水平对发酵的控制 | 第16页 |
| 1.4.2 细胞水平对发酵的控制 | 第16-17页 |
| 1.4.3 工程水平对发酵的控制 | 第17-18页 |
| 1.5 酶的固定化 | 第18-20页 |
| 1.5.1 固定化简介 | 第18-19页 |
| 1.5.2 固定化的理性设计 | 第19-20页 |
| 1.6 实验的目的与意义 | 第20-22页 |
| 1.6.1 实验目的 | 第20页 |
| 1.6.2 实验意义 | 第20-22页 |
| 第二章 脱乙酰基酯酶在大肠杆菌中的诱导表达 | 第22-36页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 实验材料 | 第22-24页 |
| 2.2.1 培养基 | 第22页 |
| 2.2.2 实验所需溶液与试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.3 实验所需仪器与设备 | 第23页 |
| 2.2.4 菌株与质粒 | 第23-24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-28页 |
| 2.3.1 提取枯草芽孢杆菌的总基因组 | 第24-25页 |
| 2.3.2 目的基因的获得与鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.3 诱导型菌株的构建 | 第26-27页 |
| 2.3.4 酶活方法的确立 | 第27页 |
| 2.3.5 酶的纯化 | 第27页 |
| 2.3.6 Km值的测定 | 第27-28页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第28-35页 |
| 2.4.1 基因组的提取 | 第28页 |
| 2.4.2 PCR扩增目的片段 | 第28-30页 |
| 2.4.3 限制性内切酶酶切与阳性克隆的筛选 | 第30-31页 |
| 2.4.4 脱乙酰基酯酶的诱导表达 | 第31-34页 |
| 2.4.5 酶的纯化与km值的测定 | 第34-35页 |
| 2.5 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 脱乙酰基酯酶在大肠杆菌中的组成表达 | 第36-49页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 实验材料 | 第36-37页 |
| 3.2.1 质粒、菌株与培养基 | 第36-37页 |
| 3.2.2 实验所需溶液与试剂 | 第37页 |
| 3.3 实验方法 | 第37-39页 |
| 3.3.1 组成型菌株的构建 | 第37-38页 |
| 3.3.2 菌体密度的测定 | 第38-39页 |
| 3.3.3 蛋白浓度测定 | 第39页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第39-48页 |
| 3.4.1 组成型菌株的构建 | 第39-43页 |
| 3.4.2 间隔序列碱基组成对CAH表达的影响 | 第43-45页 |
| 3.4.3 终止子有无对CAH表达的影响 | 第45-46页 |
| 3.4.4 不同基因对蛋白表达的影响 | 第46-47页 |
| 3.4.5 宿主对CAH表达的影响 | 第47-48页 |
| 3.5 本章小结 | 第48-49页 |
| 第四章 重组菌摇瓶发酵条件的优化及罐上放大优化 | 第49-65页 |
| 4.1 引言 | 第49页 |
| 4.2 实验材料 | 第49页 |
| 4.2.1 培养基 | 第49页 |
| 4.2.2 实验所需溶液与试剂 | 第49页 |
| 4.3 实验方法 | 第49-50页 |
| 4.3.1 摇瓶种子的优化 | 第50页 |
| 4.3.2 摇瓶发酵培养基组份的优化 | 第50页 |
| 4.3.3 摇瓶发酵条件的优化 | 第50页 |
| 4.3.4 发酵罐的放大优化 | 第50页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第50-64页 |
| 4.4.1 摇瓶发酵接种时机的优化 | 第50-51页 |
| 4.4.2 摇瓶发酵接种量的优化 | 第51-52页 |
| 4.4.3 摇瓶发酵碳源种类的优化 | 第52-53页 |
| 4.4.4 摇瓶发酵氮源种类的优化 | 第53-54页 |
| 4.4.5 摇瓶发酵碳源浓度的优化 | 第54-55页 |
| 4.4.6 摇瓶发酵氮源浓度的优化 | 第55-57页 |
| 4.4.7 摇瓶发酵无机盐浓度的优化 | 第57-59页 |
| 4.4.8 摇瓶发酵培养温度的优化 | 第59页 |
| 4.4.9 摇瓶发酵培养基优化后的培养进程曲线 | 第59-60页 |
| 4.4.10 发酵罐放大优化 | 第60-62页 |
| 4.4.11 7L发酵罐培养进程曲线 | 第62-64页 |
| 4.5 本章小结 | 第64-65页 |
| 第五章 脱乙酰基酯酶的固定化及其性质研究 | 第65-82页 |
| 5.1 引言 | 第65页 |
| 5.2 实验材料 | 第65页 |
| 5.3 实验方法 | 第65-66页 |
| 5.3.1 载体活化 | 第65-66页 |
| 5.3.2 CAH的固定化 | 第66页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第66-80页 |
| 5.4.1 氨基载体固定化条件的优化 | 第66-70页 |
| 5.4.2 环氧基载体固定化条件的优化 | 第70-74页 |
| 5.4.3 固定化酶最适反应温度 | 第74-75页 |
| 5.4.4 固定化酶最适反应pH | 第75-76页 |
| 5.4.5 固定化酶温度稳定性 | 第76-77页 |
| 5.4.6 固定化酶pH稳定性 | 第77-79页 |
| 5.4.7 固定化酶的底物耐受性 | 第79-80页 |
| 5.4.8 固定化酶的批次稳定性 | 第80页 |
| 5.5 本章小结 | 第80-82页 |
| 第六章 结论与展望 | 第82-84页 |
| 6.1 结论 | 第82-83页 |
| 6.2 展望 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
