| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-25页 |
| 1.1 致病杆菌概论 | 第12-14页 |
| 1.2 致病杆菌中的活性物质 | 第14-17页 |
| 1.2.1 杀虫毒素蛋白 | 第14-16页 |
| 1.2.2 抑菌活性物质 | 第16-17页 |
| 1.3 基因组文库的构建 | 第17-21页 |
| 1.3.1 Cosmid文库 | 第18-19页 |
| 1.3.2 Fosmid文库 | 第19-20页 |
| 1.3.3 BAC文库 | 第20页 |
| 1.3.4 其他的大片段文库 | 第20-21页 |
| 1.4 Red/ET同源重组 | 第21-22页 |
| 1.4.1 Red/ET同源重组的原理 | 第21-22页 |
| 1.4.2 Red/ET同源重组的优点及应用 | 第22页 |
| 1.5 致病杆菌的应用前景 | 第22-23页 |
| 1.6 立题依据和意义 | 第23-25页 |
| 第二章 材料与方法 | 第25-45页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-31页 |
| 2.1.1 质粒、菌株和细胞 | 第25-26页 |
| 2.1.2 培养基和抗生素 | 第26-27页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第27-28页 |
| 2.1.4 主要试剂及试剂盒 | 第28-30页 |
| 2.1.5 引物 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-45页 |
| 2.2.1 致病杆菌基因组Fosmid文库构建 | 第31-33页 |
| 2.2.2 致病杆菌基因组Fosmid文库构建特征分析 | 第33-34页 |
| 2.2.3 致病杆菌基因组Fosmid文库功能基因筛选 | 第34-36页 |
| 2.2.4 目的基因的PCR扩增 | 第36-37页 |
| 2.2.5 Red/ET同源重组构建pCC1FOS-Δsrf ABC敲除菌株 | 第37-38页 |
| 2.2.6 DH5α 感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 2.2.7 pMD-srf ABC天然表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.8 Red/ET同源重组构建pMD-srf AB△C敲除菌株 | 第39-40页 |
| 2.2.9 pET28a-srf A,pSmart-srf B, pSmart-srf C异源表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.10 工程菌的构建 | 第41页 |
| 2.2.11 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第41-42页 |
| 2.2.12 目的蛋白的纯化 | 第42页 |
| 2.2.13 Srf ABC全蛋白作用细胞后荧光染色观察细胞形态变化 | 第42-43页 |
| 2.2.14 Srf ABC全蛋白对CF203/2.5 细胞的生长抑制作用 | 第43页 |
| 2.2.15 CF203/2.5 细胞的DNA片段化检测 | 第43-44页 |
| 2.2.16 Western blotting检测Srf A/Srf B/Srf C蛋白的表达情况 | 第44-45页 |
| 第三章 实验结果 | 第45-66页 |
| 3.1 X. stockiae HN_xs01菌株基因组的提取 | 第45页 |
| 3.2 Xenorhabdus基因组Fosmid文库特征分析 | 第45-47页 |
| 3.2.1 文库中阳性克隆检测 | 第45-46页 |
| 3.2.2 Fosmid克隆在继代培养前后的稳定性检测 | 第46-47页 |
| 3.2.3 Fosmid克隆插入片段大小检测 | 第47页 |
| 3.3 Xenorhabdus基因组Fosmid文库的筛选 | 第47-50页 |
| 3.3.1 Xenorhabdus基因组Fosmid文库的初筛 | 第47-49页 |
| 3.3.2 Xenorhabdus基因组Fosmid文库的复筛 | 第49-50页 |
| 3.4 Red/ET同源重组构建srf ABC敲除载体pCC1FOS-Δsrf ABC | 第50-51页 |
| 3.4.1 PCR扩增kan基因 | 第50-51页 |
| 3.4.2 敲除载体pCC1FOS-Δsrf ABC的PCR检测 | 第51页 |
| 3.5 pCC1FOS-Δsrf ABC敲除菌株上清蛋白细胞的毒性作用情况 | 第51-52页 |
| 3.6 pMD-srf ABC重组质粒的构建 | 第52-53页 |
| 3.7 Srf ABC全蛋白的细胞毒性实验分析 | 第53-54页 |
| 3.8 Srf ABC全蛋白对细胞活性和细胞增殖影响 | 第54页 |
| 3.9 Srf ABC全蛋白作用细胞后荧光染色观察细胞形态变化 | 第54-55页 |
| 3.10 DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳检测 | 第55-56页 |
| 3.11 Red/ET同源重组构建pMD-srf AB△C敲除载体 | 第56-57页 |
| 3.12 pMD-srf AB△C菌体上清蛋白的细胞毒性实验分析 | 第57-58页 |
| 3.13 异源表达载体的构建 | 第58-61页 |
| 3.13.1 pET28a-srf A异源表达载体的构建与酶切检测 | 第58-59页 |
| 3.13.2 pSmart-srf B异源表达载体的构建与酶切鉴定 | 第59-60页 |
| 3.13.3 pSmart-srf C异源表达载体的构建与酶切鉴定 | 第60-61页 |
| 3.14 Srf A，Srf B，Srf C蛋白的诱导表达 | 第61-62页 |
| 3.15 Srf A，Srf B，Srf C蛋白的纯化脱盐 | 第62-64页 |
| 3.16 Srf A，Srf B，Srf C蛋白的Western blot检测 | 第64页 |
| 3.17 Srf A，Srf B，Srf C蛋白细胞毒性实验分析 | 第64-66页 |
| 第四章 讨论 | 第66-69页 |
| 4.1 致病杆菌基因组Fosmid文库技术体系的构建 | 第66页 |
| 4.2 高效筛选方法的建立 | 第66-67页 |
| 4.3 Srf ABC蛋白影响CF203/2.5 细胞的结构 | 第67页 |
| 4.4 Srf A，Srf B，Srf C蛋白的表达和纯化 | 第67-68页 |
| 4.5 Srf A，Srf B，Srf C蛋白的细胞毒性实验分析 | 第68页 |
| 4.6 Srf ABC蛋白的作用机理研究 | 第68-69页 |
| 第五章 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-78页 |
| 缩略语表 | 第78-79页 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 | 第79-80页 |
| 课题受资助的项目 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
