| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 英文缩写词表 | 第15-18页 |
| 第一章 文章综述 | 第18-44页 |
| 1.1 背景介绍 | 第18-20页 |
| 1.1.1 病原学特征 | 第18-19页 |
| 1.1.2 Norovirus的基因型分类 | 第19-20页 |
| 1.2 Norovirus流行病学特征 | 第20-25页 |
| 1.2.1 传播概况 | 第20页 |
| 1.2.2 传染源、传播方式和宿主易感性 | 第20-22页 |
| 1.2.3 临床症状 | 第22页 |
| 1.2.4 临床诊断治疗和预防措施 | 第22页 |
| 1.2.5 实验室检测手段 | 第22-25页 |
| 1.2.5.1 电镜法 | 第23页 |
| 1.2.5.2 免疫法 | 第23-24页 |
| 1.2.5.3 分子生物学方法 | 第24-25页 |
| 1.3 Norovirus基因组结构特征 | 第25-31页 |
| 1.3.1 Norovirus衣壳蛋白和VLPs | 第26页 |
| 1.3.2 P二聚体和P粒子 | 第26-28页 |
| 1.3.3 Norovirus与HBGA之间的反应模型 | 第28-31页 |
| 1.4 Norovirus疫苗研究进展 | 第31-33页 |
| 1.5 植物可食性疫苗表达系统 | 第33-41页 |
| 1.5.1 植物可食疫苗 | 第33-34页 |
| 1.5.2 植物表达系统的分类 | 第34-36页 |
| 1.5.2.1 稳定整合系统 | 第34-35页 |
| 1.5.2.2 瞬时整合系统 | 第35-36页 |
| 1.5.3 植物可食性疫苗优势 | 第36页 |
| 1.5.4 植物可食疫苗的研究现状 | 第36-38页 |
| 1.5.5 植物生产可食性疫苗瓶颈和解决策略 | 第38-41页 |
| 1.5.5.1 外源蛋白表达量低，免疫剂量不确定 | 第39页 |
| 1.5.5.2 服时活性易受影响 | 第39-40页 |
| 1.5.5.3 植物疫苗生物安全性问题 | 第40-41页 |
| 1.6 番茄受体表达系统的选择 | 第41-44页 |
| 1.6.1 受体植株的选择 | 第41页 |
| 1.6.2 番茄是较理想的.服疫苗生产受体植物 | 第41-42页 |
| 1.6.3 本研究的目的和意义 | 第42-44页 |
| 第二章 用大肠杆菌（ E scher ichia c oli）表达N V疫苗 | 第44-75页 |
| 2.1 实验材料 | 第44-48页 |
| 2.1.1 菌株和载体 | 第44页 |
| 2.1.2 药品 | 第44-45页 |
| 2.1.3 试剂耗材 | 第45-46页 |
| 2.1.4 试剂盒 | 第46页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第46-47页 |
| 2.1.6 引物序列 | 第47-48页 |
| 2.2 载体构建 | 第48-56页 |
| 2.2.1 基因合成 | 第48-49页 |
| 2.2.2 构建表达载体 | 第49-54页 |
| 2.2.2.1 构建流程如图 | 第50页 |
| 2.2.2.2 质粒抽提 | 第50-51页 |
| 2.2.2.3 酶切 | 第51-52页 |
| 2.2.2.4 产物胶回收 | 第52-53页 |
| 2.2.2.5 回收产物连接 | 第53页 |
| 2.2.2.6 大肠杆菌（DH5α）感受态细胞制备（CaCl2法） | 第53-54页 |
| 2.2.3 热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第54页 |
| 2.2.4 阳性克隆载体的检测和确定 | 第54-56页 |
| 2.2.4.1 PCR检测初步确定阳性克隆 | 第54-56页 |
| 2.2.4.2 测序确定阳性克隆载体 | 第56页 |
| 2.2.5 载体转化大肠杆菌BL21 | 第56页 |
| 2.3 P粒子诱导表达及蛋白检测 | 第56-63页 |
| 2.3.1 P粒子温度梯度和时间梯度诱导 | 第56页 |
| 2.3.2 SDS-PAGE分离检测蛋白 | 第56-58页 |
| 2.3.3 P粒子Western Blotting分析 | 第58-60页 |
| 2.3.4 外源蛋白的可溶性分析 | 第60页 |
| 2.3.5 目的蛋白P粒子的纯化 | 第60-62页 |
| 2.3.6 纯化目的蛋白浓度测定 | 第62-63页 |
| 2.4 透射电镜观察P粒子形态 | 第63页 |
| 2.5 实验结果与分析 | 第63-73页 |
| 2.5.1 原核表达载体的构建 | 第63-65页 |
| 2.5.2 重组质粒转化和检测 | 第65-66页 |
| 2.5.3 P粒子诱导表达及western blotting检测 | 第66-69页 |
| 2.5.4 目的蛋白可溶性的分析 | 第69-70页 |
| 2.5.5 目的蛋白纯化 | 第70-71页 |
| 2.5.6 目的蛋白浓度测定 | 第71-72页 |
| 2.5.7 电镜观察P粒子形态 | 第72-73页 |
| 2.6 实验小结 | 第73-75页 |
| 第三章 No rovir us P粒子在番茄中表达 | 第75-121页 |
| 3.1 材料和试剂 | 第75-79页 |
| 3.1.1 菌株和植物材料 | 第75页 |
| 3.1.2 载体 | 第75-76页 |
| 3.1.3 寡核苷酸引物 | 第76-77页 |
| 3.1.4 试剂和耗材 | 第77-78页 |
| 3.1.5 试剂盒 | 第78-79页 |
| 3.1.6 主要仪器设备 | 第79页 |
| 3.2 实验方法 | 第79-101页 |
| 3.2.1 技术路线 | 第79-80页 |
| 3.2.2 E8::PGENE载体构建 | 第80-83页 |
| 3.2.2.1 构建思路 | 第80页 |
| 3.2.2.2 质粒提取 | 第80页 |
| 3.2.2.3 酶切 | 第80-82页 |
| 3.2.2.4 感受态细胞的制备和转化DH5α | 第82页 |
| 3.2.2.5 阳性克隆载体的检测和确定 | 第82-83页 |
| 3.2.3 P粒子在番茄细胞中表达 | 第83-85页 |
| 3.2.3.1、根癌农杆菌感受态的制备 | 第83-84页 |
| 3.2.3.2 番茄的遗传转化 | 第84-85页 |
| 3.2.4 再生番茄植株阳性筛选 | 第85-94页 |
| 3.2.4.1 番茄植株的PCR检测 | 第85-87页 |
| 3.2.4.2 转基因抗性植株的Southern blotting检测分析 | 第87-94页 |
| 3.2.5 RT-qPCR检测转录水平表达量 | 第94-98页 |
| 3.2.5.1 转基因抗性番茄RNA提取 | 第94-96页 |
| 3.2.5.2 反转录成为cDNA | 第96页 |
| 3.2.5.3 转基因mRNA的荧光定量PCR检测 | 第96-98页 |
| 3.2.6 PGENE在番茄果实中表达蛋白的分析 | 第98-101页 |
| 3.2.6.1 抗性番茄果实总蛋白提取（冰浴） | 第98页 |
| 3.2.6.2 抗性番茄果实可溶蛋白SDS-PAGE胶 和Western blotting检测 | 第98-99页 |
| 3.2.6.3 可溶性总蛋白浓度测定 | 第99-101页 |
| 3.2.7 P粒子电镜观察 | 第101页 |
| 3.3 实验结果分析 | 第101-120页 |
| 3.3.1 E8::PGENE载体构建 | 第101-103页 |
| 3.3.2 大肠杆菌PCR检测和测序结果 | 第103-104页 |
| 3.3.3 E8::PGENE转化农杆菌检测结果 | 第104-105页 |
| 3.3.4 获得带有目的基因的再生番茄阳性株 | 第105-106页 |
| 3.3.5 再生番茄抗性筛选 | 第106-109页 |
| 3.3.6 阳性植株的Southern blotting分析结果 | 第109-111页 |
| 3.3.7 RT-qPCR检测转录水平表达量 | 第111-114页 |
| 3.3.8 PGENE蛋白在果实中特异表达分析 | 第114-116页 |
| 3.3.9 转基因抗性番茄果实可溶性总蛋白浓度的测定 | 第116-117页 |
| 3.3.10 转基因抗性番茄果实特异性蛋白浓度的测定 | 第117-119页 |
| 3.3.11 透射电镜观察植株表达P粒子形态 | 第119-120页 |
| 3.4 小结 | 第120-121页 |
| 第四章 番茄果实动物免疫试验 | 第121-136页 |
| 4.1 实验材料 | 第121-122页 |
| 4.1.1 实验样品及实验动物 | 第121页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第121-122页 |
| 4.1.3 主要仪器及耗材 | 第122页 |
| 4.2 实验方法 | 第122-128页 |
| 4.2.1 基础实验操作及技术路线 | 第122-123页 |
| 4.2.2 免疫原的制备 | 第123-124页 |
| 4.2.2.1 原核表达的蛋白免疫原制备 | 第123页 |
| 4.2.2.2 番茄植株表达的蛋白免疫原制备 | 第123-124页 |
| 4.2.3 小鼠抗血清的制备 | 第124-125页 |
| 4.2.4 小鼠血清质量检测 | 第125-127页 |
| 4.2.4.1 目的蛋白与抗血清最佳反应浓度检测 | 第125-127页 |
| 4.2.4.2 血清的效价检测 | 第127页 |
| 4.2.5 Western Blotting验证免疫功能（特异性） | 第127-128页 |
| 4.3 结果 | 第128-134页 |
| 4.3.1 靶蛋白与抗血清最佳反应浓度 | 第128页 |
| 4.3.2 抗血清效价检测 | 第128-130页 |
| 4.3.3 靶蛋白免疫功能验证（特异性） | 第130-134页 |
| 4.3.3.1 pET32a-PGENE表达的靶蛋白的免疫原性检测（原核血清vs原核抗原） | 第130-132页 |
| 4.3.3.2 原核表达蛋白生物学活性检测（原核血清vs植株抗原 | 第132-133页 |
| 4.3.3.3 植物表达系统产生的靶蛋白功能检测 （ 植株免疫血清VS原核和植株抗原和真核抗原） | 第133-134页 |
| 4.4 小结 | 第134-136页 |
| 第五章 讨论与展望 | 第136-141页 |
| 5.1 讨论 | 第136-137页 |
| 5.1.1 用大肠杆菌表达Norovirus亚基疫苗 | 第136页 |
| 5.1.2 用番茄表达Norovirus亚基疫苗 | 第136-137页 |
| 5.1.3 动物免疫实验 | 第137页 |
| 5.1.3.1 原核表达蛋白免疫血清的获得 | 第137页 |
| 5.1.3.2 番茄植株表达外源蛋白免疫血清的获得 | 第137页 |
| 5.2 结论 | 第137-138页 |
| 5.3 创新点与不足 | 第138-139页 |
| 5.3.1 创新点 | 第138-139页 |
| 5.3.2 遇到的困难与不足 | 第139页 |
| 5.4 后续工作 | 第139-141页 |
| 附录 | 第141-143页 |
| 参考文献 | 第143-157页 |
| 致谢 | 第157-159页 |
| 硕士学位期间已发表或录用的专利和论文 | 第159页 |
