| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌 | 第12页 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌表达系统简介 | 第12-15页 |
| 1.2.1 芽孢杆菌的Sigma因子 | 第13-14页 |
| 1.2.2 常用的枯草芽孢杆菌表达载体 | 第14-15页 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌的启动子 | 第15-17页 |
| 1.3.1 组成型启动子 | 第15-16页 |
| 1.3.2 诱导型启动子 | 第16-17页 |
| 1.4 通过启动子策略实现基因的高效表达 | 第17-20页 |
| 1.4.1 新型启动子实现基因的高效表达 | 第17-19页 |
| 1.4.2 启动子改造实现基因的高效表达 | 第19页 |
| 1.4.3 人工双启动子的构建实现基因的高效表达 | 第19-20页 |
| 1.5 启动子的预测方法 | 第20-21页 |
| 1.6 研究目的和意义 | 第21-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 主要酶和试剂 | 第22页 |
| 2.1.3 主要仪器和培养基 | 第22-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-36页 |
| 2.2.1 探针载体PUC-kana的构建及启动子的筛选 | 第24-26页 |
| 2.2.2 重组质粒pHCMC04-Pk3-sva的构建 | 第26页 |
| 2.2.3 重组质粒粗酶酶活力的测定 | 第26-28页 |
| 2.2.4 重组酶SVA的酶学性质 | 第28页 |
| 2.2.5 表达载体pHCMC04-PaprE-sva的构建 | 第28-30页 |
| 2.2.6 表达载体pHCMC04-P43-sva的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.7 启动子的串联 | 第31-34页 |
| 2.2.8 重组酶活性的测定及SDS-PAGE分析 | 第34页 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第34页 |
| 2.2.10 连接产物转化E.coli DH5α | 第34-35页 |
| 2.2.11 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| 第三章 结果与分析 | 第36-57页 |
| 3.1 PK3启动子的克隆及功能验证 | 第36-42页 |
| 3.1.1 PUC-kana探针型载体的构建 | 第36-37页 |
| 3.1.2 野生型芽孢杆菌的筛选和基因组DNA的提取 | 第37-39页 |
| 3.1.3 活性片段的筛选 | 第39页 |
| 3.1.4 PHCMC04-Pkn-sva表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 3.1.5 启动子转录活性的鉴定 | 第40-42页 |
| 3.2 Bacillus subtilis中麦芽糖α-淀粉酶SVA的酶学性质 | 第42-44页 |
| 3.2.1 重组酶sva的最适pH | 第42-43页 |
| 3.2.2 重组酶sva的最适温度 | 第43页 |
| 3.2.3 重组菌pHCMC04-Pk3-sva生长曲线及酶活曲线 | 第43-44页 |
| 3.3 PaprE/P43双启动子的构建和功能研究 | 第44-52页 |
| 3.3.1 表达载体pHCMC04-PaprE-sva的构建 | 第44-45页 |
| 3.3.2 PaprE启动子转录活性的鉴定 | 第45页 |
| 3.3.3 pHCMC04-PaprE-sva重组菌的生长曲线及酶活曲线 | 第45-47页 |
| 3.3.4 重组质粒pHCMC04-P43-sva的构建 | 第47-48页 |
| 3.3.5 P43启动子转录活性的鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.6 pHCMC04-P43-sva重组菌的生长曲线及酶活曲线 | 第49页 |
| 3.3.7 PaprE/P43双启动子表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 3.3.8 重组菌的生长曲线及重组酶sva的酶活曲线 | 第50-52页 |
| 3.4 Pglv/P43双启动子的构建和功能研究 | 第52-57页 |
| 3.4.1 Pglv/P43双启动子表达载体的构建 | 第52-53页 |
| 3.4.2 pHCMC04-Pglv-sva麦芽糖诱导最佳浓度 | 第53-54页 |
| 3.4.3 诱导条件下重组质粒的表达 | 第54-57页 |
| 第四章 讨论 | 第57-62页 |
| 4.1 麦芽糖α-淀粉酶基因在B.subtilis中的表达 | 第57-58页 |
| 4.2 枯草芽孢杆菌启动子的研究 | 第58-62页 |
| 4.2.1 新型启动子的克隆 | 第58页 |
| 4.2.2 双启动子表达外源基因的研究 | 第58-62页 |
| 第五章 结论与展望 | 第62-64页 |
| 5.1 结论 | 第62-63页 |
| 5.1.1 通过构建小型的启动子探针质粒筛选启动子 | 第62页 |
| 5.1.2 不同类型启动子串联对sva基因表达的影响 | 第62-63页 |
| 5.2 展望 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-72页 |
| 附录一 | 第72-75页 |
| 附录二 | 第75-77页 |
| 附录三 | 第77-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文目录 | 第82页 |
