| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-11页 |
| 目录 | 第11-17页 |
| 第一章 综述 | 第17-40页 |
| 1 磁性纳米粒子及其在生物医学领域的应用 | 第17-25页 |
| ·磁性纳米粒子的特性 | 第17-18页 |
| ·磁性纳米粒子的制备方法 | 第18-20页 |
| ·磁性纳米粒子在生物医学领域中的应用 | 第20-25页 |
| 2 功能性小分子及其靶点筛选方法 | 第25-33页 |
| ·关于功能性小分子 | 第25页 |
| ·关于天然产物 | 第25页 |
| ·天然产物的来源 | 第25-27页 |
| ·天然产物的作用靶点及其筛选方法 | 第27-33页 |
| ·关于天然产物的作用靶点 | 第27页 |
| ·天然产物未知作用靶点的筛选方法 | 第27-33页 |
| ·表型基础上的靶点筛选 | 第28-29页 |
| ·亲和基础上的靶点筛选 | 第29-33页 |
| 3 关于石杉碱甲(Huperzine A,Hup A) | 第33-35页 |
| 4 关于二核苷多磷酸(Xp_nX) | 第35-37页 |
| ·二核苷多磷酸的定义 | 第35页 |
| ·二核苷多磷酸的功能 | 第35-36页 |
| ·关于二腺苷多磷酸(Ap_nA) | 第36-37页 |
| 5 研究的目的与内容 | 第37-40页 |
| 第二章 磁性纳米粒子的制备及其与石杉碱甲的连接 | 第40-48页 |
| 1 引言 | 第40页 |
| 2 实验材料和方法 | 第40-44页 |
| ·实验材料和仪器 | 第40-41页 |
| ·实验方法 | 第41-44页 |
| ·磁性纳米颗粒的合成方法 | 第41-42页 |
| ·磁性纳米粒子的表征 | 第42-43页 |
| ·磁性纳米粒子的水和粒径的检测 | 第42页 |
| ·磁性粒子表面活性基团(羧基)的检测：磁性颗粒和4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(BrMmC)的连接 | 第42-43页 |
| ·磁性纳米粒子的交连 | 第43页 |
| ·磁性纳米粒子与石杉碱甲的连接 | 第43-44页 |
| 3 实验结果及讨论 | 第44-47页 |
| ·所制备的磁性纳米粒子的粒径和电位(PCS检测结果) | 第44-45页 |
| ·磁性粒子上活性基团的检测 | 第45-46页 |
| ·石杉碱甲与磁性纳米粒子的连接(红外扫描结果) | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 第三章 利用磁生物淘洗技术从噬菌体展示库里进行石杉碱甲的靶点筛选 | 第48-61页 |
| 1 引言 | 第48-49页 |
| 2 实验材料及方法 | 第49-57页 |
| ·实验材料 | 第49-52页 |
| ·主要实验材料 | 第49-50页 |
| ·实验试剂的配制 | 第50-52页 |
| ·主要实验仪器和设备 | 第52页 |
| ·实验方法 | 第52-57页 |
| ·噬菌体滴度测定 | 第52-53页 |
| ·T7 Select cDNA展示库的亲和生物淘洗 | 第53-54页 |
| ·筛选到的特异性噬菌体的PCR扩增反应 | 第54-55页 |
| ·凝胶电泳检测并纯化PCR扩增片段 | 第55页 |
| ·PCR纯化产物的克隆及测序 | 第55-56页 |
| ·筛选到的噬菌体所展示的核酸的序列比对 | 第56-57页 |
| 3 实验结果及讨论 | 第57-59页 |
| ·筛选到的噬菌体进行PCR的结果(第四次筛选后,挑取的10个噬菌斑) | 第57页 |
| ·重复筛选到的特异性噬菌体上所展示的基因序列及BLAST结果 | 第57-58页 |
| ·没有被重复筛选到的特异性噬菌体上所展示的基因的BLAST结果 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 第四章 重复筛选出的特异性噬菌体与石杉碱甲之间相互作用的进一步鉴定 | 第61-80页 |
| 1 引言 | 第61-66页 |
| ·关于毛细管电泳技术及其在生物医学领域的应用 | 第61页 |
| ·利用毛细管电泳技术测定药物和蛋白质的结合常数 | 第61-66页 |
| ·Humme I-Dreyer | 第62-63页 |
| ·利用Scatchard方程分析计算出结合常数 | 第63-66页 |
| 2 实验材料及方法 | 第66-69页 |
| ·实验材料及试剂 | 第66-67页 |
| ·实验方法 | 第67-69页 |
| ·筛选到的两种特异性噬菌体以及任意一种非特异性噬菌体的单克隆扩增 | 第67页 |
| ·超高速CsCl密度梯度离心纯化噬菌体 | 第67-68页 |
| ·毛细管区带电泳分析石杉碱甲与筛选出的特异性噬菌体以及非特异性噬菌体的结合 | 第68-69页 |
| 3 实验结果及讨论 | 第69-78页 |
| ·石杉碱甲与一种特异性的噬菌体(展示线粒体的一段基因的噬菌体)的结合情况 | 第69-72页 |
| ·石杉碱甲与另外一种特异性的噬菌体(展示X-染色体的一段基因的噬菌体)的结合情况 | 第72-75页 |
| ·石杉碱甲与非特异性的噬菌体结合的毛细管区带电泳分析 | 第75-78页 |
| 4 讨论 | 第78-80页 |
| 第五章 重复筛选出的特异性噬菌体展示基因所在蛋白的体外表达与纯化及其与石杉碱甲之间相互作用的鉴定 | 第80-98页 |
| 1 引言 | 第80页 |
| 2 实验材料和方法 | 第80-88页 |
| ·实验材料和仪器 | 第80-81页 |
| ·实验方法 | 第81-88页 |
| ·线粒体NADH脱氢酶subunit 1基因的PCR扩增 | 第81-82页 |
| ·PCR扩增产物的序列鉴定 | 第82-83页 |
| ·目的基因与表达载体的连接 | 第83-85页 |
| ·含有目的基因的表达载体转化入表达菌株及其鉴定 | 第85-86页 |
| ·目的蛋白的体外诱导表达条件的优化 | 第86页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第86-87页 |
| ·目的蛋白的western-blot验证 | 第87页 |
| ·SPR(表面等离子共振)技术检测目的蛋白与石杉碱甲之间的体外结合 | 第87-88页 |
| 3 实验结果 | 第88-96页 |
| ·线粒体NADH脱氢酶subunit 1基因的PCR扩增 | 第88-89页 |
| ·目的基因与表达载体连接物转入DH5 a菌株后提质粒酶切鉴定 | 第89页 |
| ·含有目的基因的表达载体转化入表达菌株BL21 DE3后的鉴定 | 第89-90页 |
| ·目的蛋白的体外诱导表达条件的优化 | 第90-92页 |
| ·目的蛋白的大规模诱导表达及纯化 | 第92-94页 |
| ·诱导表达后蛋白的western-blotting验证 | 第94-95页 |
| ·SPR(表面等离子共振)技术检测目的蛋白与石杉碱甲之间的体外结合 | 第95-96页 |
| 4 讨论 | 第96-98页 |
| 第六章 利用磁生物淘洗技术从真核生物组织裂解液里进行石杉碱甲的靶点再筛选及体内结合的验证 | 第98-109页 |
| 1 引言 | 第98页 |
| 2 实验材料和方法 | 第98-100页 |
| ·实验材料 | 第98-99页 |
| ·实验方法 | 第99-100页 |
| ·石杉碱甲与自制的带羧基的磁珠之间的连接及验证(同第二章的2.2.4) | 第99页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从鼠脑组织裂解物里筛选Hup A的靶点 | 第99-100页 |
| ·C57b 1/6 小鼠脑组织裂解物的制备 | 第99页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从小鼠脑组织裂解物里筛选Hup A的靶点 | 第99-100页 |
| 3 实验结果 | 第100-106页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从真核生物组织裂解液里筛选Hup A的靶点 | 第100-102页 |
| ·从真核生物组织裂解液(小鼠的脑组织裂解液)里筛选Hup A的靶点的SDS-PAGE结果 | 第100-101页 |
| ·从真核组织裂解液(小鼠的脑组织裂解液)里筛选Hup A的靶点的质谱检测结果 | 第101-102页 |
| ·体内验证石杉碱甲与线粒体功能蛋白的相互作用,尤其是与筛选到的特异性蛋白-线粒体NADH脱氢酶以及ATP synthase的相互作用,集中在石杉碱甲对于蛋白活性的影响(因为别人已经做了相关研究,我们认为重复做是没有太大意义的,特此引用他人的PAPER,特此声明.)[141,142] | 第102-106页 |
| ·石杉碱甲对于线粒体NADH脱氢酶和ATP synthase的蛋白活性的影响的细胞实验(引用别人的研究) | 第103-104页 |
| ·石杉碱甲对于线粒体NADH脱氢酶的蛋白活性影响的细胞实验 | 第103-104页 |
| ·石杉碱甲对于线粒体ATP synthase的蛋白活性的影响的细胞实验 | 第104页 |
| ·石杉碱甲对于线粒体NADH脱氢酶和ATP synthase的蛋白活性的影响的动物实验 | 第104-106页 |
| ·石杉碱甲对于线粒体NADH脱氢酶的蛋白活性的影响 | 第104-105页 |
| ·石杉碱甲对于线粒体ATP synthase的蛋白活性的影响 | 第105-106页 |
| 4 讨论 | 第106-109页 |
| 第七章 5',5'''-P1,P4-二腺苷四磷酸(Ap_4A)及其功能性衍生物的体外合成,纯化和鉴定 | 第109-128页 |
| 1 引言 | 第109页 |
| 2 实验材料和方法 | 第109-115页 |
| ·实验材料和仪器 | 第109-110页 |
| ·实验方法 | 第110-115页 |
| ·二腺苷四磷酸(Ap_4A)的体外合成及鉴定 | 第110页 |
| ·Ap_4A的体外合成 | 第110页 |
| ·Ap_4A的纯化及鉴定 | 第110页 |
| ·二腺苷三磷酸(Ap_3A)的体外合成及鉴定 | 第110-111页 |
| ·Ap_3A的体外合成 | 第110-111页 |
| ·Ap_3A的纯化及鉴定 | 第111页 |
| ·带有乙二胺(ethylenediamine)的二腺苷三磷酸(diamine-Ap_3A)的体外合成及鉴定 | 第111-112页 |
| ·带有乙二胺的ADP(diamine-ADP)的合成及纯化鉴定 | 第111页 |
| ·diamine-Ap_3A的体外合成及鉴定 | 第111-112页 |
| ·带有二乙基三胺(diethylenetriamine)的二腺苷四磷酸(triamine-Ap_4A)的体外合成及鉴定 | 第112-113页 |
| ·带有二乙基三胺(diethylenetriamine)的ATP(triamine-ATP)的合成及纯化鉴定 | 第112-113页 |
| ·triamine-Ap_4A的体外合成及鉴定 | 第113页 |
| ·带有生物素(biotin)的二腺苷四磷酸(Biotin-C10-Ap_4A)的体外合成及鉴定 | 第113-115页 |
| ·带有生物素的ATP(Biotin-C10-ATP)的合成及纯化鉴定 | 第113-114页 |
| ·Biotin-C10-Ap_4A的合成及鉴定 | 第114-115页 |
| 3 实验结果 | 第115-126页 |
| ·Ap_4A的体外合成及鉴定 | 第115-116页 |
| ·Ap_3A的体外合成及鉴定 | 第116-118页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A(diamine-Ap_3A)的体外合成及鉴定 | 第118-122页 |
| ·带有乙二胺的ADP(diamine-ADP)的体外合成及鉴定 | 第118-120页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A(diamine-Ap_3A)的体外合成及鉴定 | 第120-122页 |
| ·带有二乙基三胺(diethylenetriamine)的二腺苷四磷酸(triamine-Ap_4A)的体外合成及鉴定 | 第122-125页 |
| ·带有二乙基三胺(diethylenetriamine)的ATP(triamine-ATP)的合成及纯化鉴定 | 第122-124页 |
| ·带有二乙基三胺(diethylenetriamine)的Ap_4A(triamine-Ap_4A)的合成及纯化鉴定 | 第124-125页 |
| ·带有生物素(biotin)的二腺苷四磷酸(Biotin-C10-Ap_4A)的体外合成及鉴定 | 第125-126页 |
| 4 讨论 | 第126-128页 |
| 第八章 ：利用磁生物淘洗技术进行5',5'''-P1,P4-二腺苷四磷酸(Ap_4A)的功能性衍生物的靶点筛选及鉴定 | 第128-148页 |
| 1 引言 | 第128页 |
| 2 实验材料和方法 | 第128-133页 |
| ·实验材料 | 第128-129页 |
| ·实验方法 | 第129-133页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A与带羧基的磁珠之间相互作用结合的检测 | 第129-130页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A与自制的带羧基的磁珠之间相互作用结合的检测 | 第129-130页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A与商用的带羧基的磁珠(Dynabeads M-270Carboxylic Acid)之间相互作用结合的检测 | 第130页 |
| ·带有生物素的Ap_4A与带链霉亲和素的磁珠之间相互作用结合的检测 | 第130-131页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从原核细胞和真核组织裂解液里筛选Ap4A的靶点 | 第131-133页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从原核细胞裂解物里筛选Ap_4A的靶点 | 第131-132页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从真核组织裂解物里筛选Ap_4A的靶点 | 第132-133页 |
| 3 实验结果及讨论 | 第133-146页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A与带羧基的磁珠之间相互作用结合的检测 | 第133-138页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A与自制的带羧基的磁珠之间相互作用结合的检测 | 第133-136页 |
| ·带有乙二胺的Ap_3A与商用的带羧基的磁珠(Dynabeads M-270)之间相互作用结合的检测 | 第136-138页 |
| ·带有生物素的Ap_4A与带链霉亲和素的磁珠之间相互作用结合的检测 | 第138-139页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从原核细胞和真核组织裂解液里筛选Ap_4A的靶点 | 第139-146页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从原核细胞裂解液里筛选Ap_4A的靶点 | 第139-143页 |
| ·从原核细胞裂解液里筛选Ap_4A的靶点的SDS-PAGE结果 | 第139-141页 |
| ·从原核细胞裂解液里筛选Ap_4A的靶点的质谱检测结果 | 第141-143页 |
| ·利用磁生物淘洗技术从真核生物组织裂解液里筛选Ap_4A的靶点 | 第143-146页 |
| ·从真核生物组织裂解液(小鼠的脑组织裂解液)里筛选Ap_4A的靶点的SDS-PAGE结果 | 第143页 |
| ·从真核组织裂解液(小鼠的脑组织裂解液)里筛选Ap_4A的靶点的质谱检测结果 | 第143-146页 |
| 4. 讨论 | 第146-148页 |
| 第九章 总结与展望 | 第148-153页 |
| 1 研究内容总结 | 第148-150页 |
| 2 创新点 | 第150页 |
| 3 展望 | 第150-153页 |
| ·建立天然产物的候选靶点库 | 第150-151页 |
| ·进一步揭示石杉碱甲以及二腺苷四磷酸的分子作用机理 | 第151-153页 |
| 参考文献 | 第153-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 | 第172-175页 |
