| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-33页 |
| 1 基因功能的研究 | 第13-14页 |
| ·生物信息学预测基因功能 | 第13-14页 |
| ·同源性反应了进化关系 | 第13页 |
| ·同源性分析可以给出整个基因或某一区段功能的信息 | 第13-14页 |
| ·研究基因功能的方法 | 第14页 |
| 2 RNA干涉现象(RNAI,RNA INTERFERENCE) | 第14-27页 |
| ·基因沉默 | 第14-15页 |
| ·RNAi技术的发现 | 第15-16页 |
| ·RNA干涉的机制和特点 | 第16-19页 |
| ·RNA干涉技术中相关酶类或蛋白质以及基因 | 第16-17页 |
| ·RNAi的作用机制 | 第17-18页 |
| ·RNAi的特点 | 第18-19页 |
| ·RNAi在哺乳动物中的研究 | 第19-22页 |
| ·siRNA的获得 | 第22-24页 |
| ·siRNA序列的设计 | 第22-23页 |
| ·siRNA的合成 | 第23-24页 |
| ·RNA干扰技术的应用及展望 | 第24-27页 |
| ·高通量研究基因的功能 | 第24-25页 |
| ·基因治疗 | 第25-26页 |
| ·信号通路 | 第26页 |
| ·局限性 | 第26-27页 |
| 3 TGF-B超家族与SMAD蛋白 | 第27-33页 |
| ·TGF—β生物学效应 | 第27-28页 |
| ·TGF—β信号传导通路 | 第28-29页 |
| ·TGF—β受体 | 第28页 |
| ·Smads蛋白 | 第28-29页 |
| ·Smad介导TGF-β信号转导 | 第29-30页 |
| ·Smads在脊椎动物中的功能 | 第30-31页 |
| ·TGF-β/Smad2,3信号通路的研究进展 | 第31-33页 |
| 第二章 研究目的及意义 | 第33-34页 |
| 第三章 材料与方法 | 第34-45页 |
| 1 材料 | 第34-37页 |
| ·实验所用细胞、菌株、质粒载体 | 第34页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第34-35页 |
| ·常用缓冲液和试剂配置 | 第35页 |
| ·质粒提取缓冲液 | 第35页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 | 第35-36页 |
| ·Western blot缓冲液 | 第36页 |
| ·抗生素类 | 第36页 |
| ·培养基 | 第36-37页 |
| ·细菌培养基 | 第36-37页 |
| ·细胞培养基 | 第37页 |
| ·主要仪器和设备 | 第37页 |
| 2 方法 | 第37-45页 |
| ·细胞培养 | 第37-38页 |
| ·DNA片段的回收 | 第38页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第38-39页 |
| ·连接产物转化 | 第39页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第39-40页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒 | 第39页 |
| ·超纯质粒的提取 | 第39-40页 |
| ·阳性克隆子的鉴定 | 第40页 |
| ·酶切鉴定 | 第40页 |
| ·序列测定 | 第40页 |
| ·半定量RT-PCR反应 | 第40-42页 |
| ·引物设计 | 第40页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第40-41页 |
| ·cDNA第一链合成 | 第41页 |
| ·PCR反应 | 第41-42页 |
| ·RT-PCR反应产物的检测 | 第42页 |
| ·SDS-PAGE和Western-blot | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第42页 |
| ·Western-blot分析 | 第42-43页 |
| ·RNA interference方法的建立 | 第43-45页 |
| ·siRNA的设计与合成 | 第43-44页 |
| ·shRNA表达质粒的构建 | 第44页 |
| ·脂质体介导的细胞转染 | 第44页 |
| ·RNA干扰效果的分析 | 第44-45页 |
| 第四章 结果与分析 | 第45-65页 |
| 1 TGF-B1诱导SMADS蛋白的表达 | 第45-48页 |
| ·TGF-β1浓度的确定 | 第45-46页 |
| ·TGF-β1浓度梯度的设置 | 第45页 |
| ·半定量RT-PCR结果 | 第45-46页 |
| ·TGF-β诱导时间的确定 | 第46-47页 |
| ·TGF-β1诱导时间分组 | 第46页 |
| ·半定量RT-PCR结果 | 第46-47页 |
| ·Western-blotting验证 | 第47-48页 |
| 2 SHRNA表达质粒的构建 | 第48-55页 |
| ·siRNA序列的设计 | 第48页 |
| ·shRNA表达质粒的构建 | 第48-54页 |
| ·线性RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen环化成载体质粒 | 第54-55页 |
| 3 SHRNA效果分析 | 第55-62页 |
| ·shRNA表达质粒的转染 | 第55-56页 |
| ·Smad2和Smad3的干扰效果 | 第56-62页 |
| ·RT-PCR分析Smad2和Smad3的mRNA表达水平 | 第56-58页 |
| ·Western-blotting分析Smad2/3的表达水平 | 第58-59页 |
| ·RNAi有效时间的确定 | 第59-60页 |
| ·在Smad2-depletion细胞和Smad3-depletion细胞中Smads蛋白之间的相互关系 | 第60-62页 |
| 4 SHRNA混合质粒干扰效果分析 | 第62-65页 |
| ·Smad2-shRNA混合质粒干扰效果的RT-PCR分析 | 第62-63页 |
| ·Smad2-shRNA混合质粒干扰效果的Western-blotting分析 | 第63页 |
| ·Smad3-shRNA混合质粒干扰效果分析 | 第63-65页 |
| 第五章 讨论 | 第65-77页 |
| 1 关于基因的功能研究 | 第65-68页 |
| 2 关于小鼠成纤维细胞 | 第68页 |
| 3 关于RNAI技术体系 | 第68-73页 |
| ·siRNA序列的设计 | 第68-69页 |
| ·关于shRNA | 第69-70页 |
| ·shRNAs导入方式 | 第70页 |
| ·siRNA效应的持续时间 | 第70-71页 |
| ·RNAi效应的分析方法 | 第71-72页 |
| ·混合RNAi质粒 | 第72-73页 |
| 4 关于TGF-B信号通路 | 第73-76页 |
| ·TGF-β1诱导时间和浓度 | 第73页 |
| ·TGF-β1诱导Smads蛋白的表达 | 第73-74页 |
| ·Smad2和Smad3的不同作用 | 第74-75页 |
| ·关于Smad4 | 第75-76页 |
| 5 下步工作计划 | 第76-77页 |
| 小结 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-92页 |
| 博士在读期间发表论文 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
