| 摘要 | 第1-19页 |
| ABSTRACT | 第19-23页 |
| 前言 | 第23-26页 |
| 第一章 盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的克隆 | 第26-46页 |
| 摘要 | 第26-27页 |
| 1. 材料与方法 | 第27-36页 |
| ·实验材料 | 第27-28页 |
| ·藻种 | 第27页 |
| ·菌种 | 第27页 |
| ·培养基及部分溶液 | 第27-28页 |
| ·酶制剂和试剂盒 | 第28页 |
| ·引物合成及测序 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28页 |
| ·实验方法 | 第28-36页 |
| ·盐藻EPSP合成酶基因EST序列的获得 | 第28-29页 |
| ·盐藻总RNA的提取 | 第29-30页 |
| ·扩增盐藻EPSP合成酶基因3’末端序列(3’RACE) | 第30-35页 |
| ·cDNA的合成 | 第30-31页 |
| ·3’末端的第一轮扩增 | 第31-32页 |
| ·巢式PCR | 第32页 |
| ·TA克隆及其验证 | 第32-35页 |
| ·扩增盐藻EPSP合成酶基因5’末端序列 | 第35-36页 |
| ·首链cDNA的合成 | 第35页 |
| ·5’末端的第一轮扩增 | 第35-36页 |
| ·巢式PCR | 第36页 |
| ·TA克隆及其验证 | 第36页 |
| 2 结果 | 第36-41页 |
| ·盐藻总RNA的提取 | 第36-37页 |
| ·3’RACE | 第37-39页 |
| ·5’RACE | 第39-41页 |
| 3 讨论 | 第41-45页 |
| ·盐藻总RNA的提取 | 第41页 |
| ·cDNA末端快速扩增法(RACE) | 第41-45页 |
| 小结 | 第45-46页 |
| 第二章 盐生杜氏藻EPSP合成酶基因的序列及结构分析 | 第46-64页 |
| 摘要 | 第46-47页 |
| 1 分析方法 | 第47-50页 |
| ·相似性搜索 | 第47页 |
| ·序列阅读框分析 | 第47页 |
| ·疏水性分析 | 第47页 |
| ·BLOCKs分析和功能结构域的预测 | 第47-48页 |
| ·叶绿体转运肽预测 | 第48页 |
| ·二级结构预测 | 第48页 |
| ·三级结构预测 | 第48-49页 |
| ·多重序列比对 | 第49-50页 |
| ·系统发育分析 | 第50页 |
| 2 分析结果 | 第50-58页 |
| ·相似性搜索 | 第50-51页 |
| ·序列开放阅读框分析 | 第51-52页 |
| ·疏水性分析 | 第52-53页 |
| ·BLOCKs分析和功能结构域预测 | 第53页 |
| ·叶绿体转运肽预测 | 第53-54页 |
| ·二级结构预测 | 第54-55页 |
| ·三级结构预测 | 第55-56页 |
| ·多重序列比对 | 第56-58页 |
| ·系统发育分析 | 第58页 |
| 3 讨论 | 第58-63页 |
| 小结 | 第63-64页 |
| 第三章 盐藻EPSP合成酶在大肠杆菌中的表达和纯化 | 第64-82页 |
| 摘要 | 第64-65页 |
| 1 实验材料 | 第65-66页 |
| ·质粒和菌株 | 第65页 |
| ·酶和主要试剂 | 第65-66页 |
| ·培养基 | 第66页 |
| ·引物合成及测序 | 第66页 |
| 2 实验方法 | 第66-71页 |
| ·盐藻EPSP合成酶的原核表达 | 第66-69页 |
| ·引物设计 | 第66-67页 |
| ·盐藻EPSP合成酶基因片段扩增 | 第67-68页 |
| ·重组表达载体的构建以及转化 | 第68-69页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第69页 |
| ·重组盐藻EPSP合成酶的纯化 | 第69-71页 |
| ·表达条件的优化 | 第69-70页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第69-70页 |
| ·诱导温度的优化 | 第70页 |
| ·GST融合蛋白的纯化 | 第70页 |
| ·去GST的重组蛋白的纯化 | 第70-71页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第71页 |
| 3 结果 | 第71-77页 |
| ·盐藻EPSP合成酶的原核表达 | 第71-73页 |
| ·表达条件的优化 | 第73-75页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第75-77页 |
| 4 讨论 | 第77-81页 |
| ·融合表达系统 | 第77-78页 |
| ·表达和酶切条件的优化 | 第78-80页 |
| ·酶切方式的选择 | 第80-81页 |
| 小结 | 第81-82页 |
| 第四章 盐藻EPSP合成酶的功能鉴定 | 第82-96页 |
| 摘要 | 第82-83页 |
| 1 实验材料和方法 | 第83-85页 |
| ·实验材料 | 第83页 |
| ·菌株 | 第83页 |
| ·主要试剂 | 第83页 |
| ·培养基 | 第83页 |
| ·实验方法 | 第83-85页 |
| ·转EPSP合成酶基因的大肠杆菌ER2799 | 第83页 |
| ·体内功能互补实验 | 第83-84页 |
| ·草甘膦抗性实验 | 第84页 |
| ·EPSP合成酶表达量同草甘膦抗性的关系 | 第84-85页 |
| ·通过诱导时间的变化来改变EPSP合成酶的表达量 | 第84页 |
| ·通过IPTG浓度的变化来改变EPSP合成酶的表达量 | 第84-85页 |
| ·芳香族氨基酸的互补作用 | 第85页 |
| 2 实验结果 | 第85-92页 |
| ·转基因大肠杆菌ER2799的构建 | 第85页 |
| ·功能互补 | 第85-87页 |
| ·盐藻EPSP合成酶提高了大肠杆菌对草甘膦的抗性 | 第87-89页 |
| ·盐藻EPSP合成酶的表达量与大肠杆菌草甘膦的抗性成正比 | 第89-91页 |
| ·通过诱导时间的变化来改变EPSP合成酶的表达量 | 第89-90页 |
| ·通过IPTG浓度的变化来改变EPSP合成酶的表达量 | 第90-91页 |
| ·芳香族氨基酸的互补作用 | 第91-92页 |
| 3 讨论 | 第92-95页 |
| 小结 | 第95-96页 |
| 第五章 盐藻EPSP合成酶与底物作用的光谱学性质分析 | 第96-107页 |
| 摘要 | 第96-97页 |
| 1 材料与方法 | 第97页 |
| ·实验材料及仪器 | 第97页 |
| ·荧光光谱测定 | 第97页 |
| 2 实验结果 | 第97-98页 |
| ·EPSP合成酶结合了S3P和PEP后的荧光变化 | 第97-98页 |
| ·草甘膦和磷离子对酶荧光光谱的影响 | 第98页 |
| 3 讨论 | 第98-106页 |
| ·S3P对酶构象的影响 | 第100-101页 |
| ·磷离子协助S3P导致酶构象的改变 | 第101-102页 |
| ·不同波长下激发出的荧光光谱 | 第102-104页 |
| ·一种可能的EPSP合成酶活性检测新方法 | 第104-106页 |
| 小结 | 第106-107页 |
| 第六章 草甘膦耐受性盐藻的培育以及其产生草甘膦耐受性的原因 | 第107-125页 |
| 摘要 | 第107-108页 |
| 1 实验材料 | 第108页 |
| ·藻种 | 第108页 |
| ·试剂和试剂盒 | 第108页 |
| ·引物合成及测序 | 第108页 |
| ·主要仪器 | 第108页 |
| 2 实验方法 | 第108-113页 |
| ·盐藻培养基及培养方法 | 第108页 |
| ·草甘膦抑制下盐藻的生长曲线 | 第108-109页 |
| ·草甘膦耐受性盐藻的培育 | 第109页 |
| ·草甘膦的胁迫处理 | 第109页 |
| ·盐藻总RNA的提取 | 第109-110页 |
| ·反转录 | 第110页 |
| ·引物设计 | 第110-111页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第111页 |
| ·实验结果的处理 | 第111-113页 |
| 3 实验结果 | 第113-119页 |
| ·草甘膦抑制下盐藻的生长曲线 | 第113页 |
| ·具有草甘膦耐受性的盐藻 | 第113-114页 |
| ·草甘膦耐受性盐藻的EPSP合成酶基因的克隆 | 第114-115页 |
| ·引物特异性的验证 | 第115页 |
| ·标准曲线和溶解曲线 | 第115-117页 |
| ·耐受不同浓度草甘膦盐藻体内EPSP合成酶的表达差异 | 第117页 |
| ·草甘膦胁迫下盐藻EPSP合成酶的表达变化 | 第117-119页 |
| 4 讨论 | 第119-124页 |
| ·草甘膦抗性获得的途径 | 第119-121页 |
| ·盐藻细胞最佳光吸收波长的确定 | 第121页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第121-124页 |
| 小结 | 第124-125页 |
| 结论 | 第125-127页 |
| 参考文献 | 第127-133页 |
| 综述 莽草酸循环 | 第133-154页 |
| 参考文献 | 第154-174页 |
| 在读期间科研成果及获奖情况 | 第174-175页 |
| 致谢 | 第175-176页 |
