| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-13页 |
| 前言 | 第13-17页 |
| 第一部分 布鲁氏菌外膜蛋白OMP31、OMP10和bp26重组表达质粒的构建及诱导表达 | 第17-37页 |
| 一材料 | 第17-18页 |
| 1.主要试剂 | 第17页 |
| 2.菌株和质粒 | 第17页 |
| 4.血清来源 | 第17-18页 |
| 5.主要仪器 | 第18页 |
| 二、方法 | 第18-21页 |
| 1.目的基因的获得: | 第18-19页 |
| 2.目的基因的克隆和阳性重组子的筛选: | 第19页 |
| 3.OMP31、bp26和OMP10目的基因片段的纯化与酶切 | 第19页 |
| 4.融合表达载体的构建 | 第19-20页 |
| ·目的基因片段与载体的连接 | 第19页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第19-20页 |
| ·转化 | 第20页 |
| 5 重组克隆的筛选及鉴定 | 第20页 |
| 6.OMP31、bp26和OMP10基因的诱导表达: | 第20页 |
| 7 OMP31蛋白表达条件的优化: | 第20-21页 |
| ·最佳诱导时机的选择 | 第20-21页 |
| ·最佳收菌时间的选择 | 第21页 |
| ·最佳IPTG诱导浓度的选择 | 第21页 |
| ·可溶性表达条件的选择 | 第21页 |
| 三、结果: | 第21-32页 |
| 1.目的基因的获得: | 第21-27页 |
| 2.克隆和PGEX-4T-1/OMP31和bp26重组表达质粒的鉴定: | 第27-28页 |
| 3.重组质粒的表达 | 第28-32页 |
| ·OMP31、bp26和OMP10基因表达条件的优化: | 第28-32页 |
| 四、讨论 | 第32-36页 |
| 小结 | 第36-37页 |
| 第二部分 重组蛋白的纯化及鉴定 | 第37-50页 |
| 一、材料 | 第37页 |
| 1.试剂 | 第37页 |
| 2.主要仪器 | 第37页 |
| 二、方法 | 第37-41页 |
| 1.包涵体的纯化 | 第37-40页 |
| ·包涵体的提取 | 第37-38页 |
| ·包涵体的洗涤 | 第38页 |
| ·包涵体的复性 | 第38-39页 |
| ·稀释复性法 | 第38页 |
| ·透析复性 | 第38-39页 |
| ·复性产物的纯化 | 第39-40页 |
| ·GST亲和层析 | 第39页 |
| ·离子交换层析 | 第39页 |
| ·复性产物的割胶回收纯化 | 第39-40页 |
| 2.GST-OMP31、GST-OMP10、GST-BP26纯化产物的血清鉴定 | 第40页 |
| 21.ELISA | 第40页 |
| ·Western-blot | 第40页 |
| 3.免疫血清的制雀 | 第40页 |
| 4.免疫血清的鉴定 | 第40-41页 |
| 三、结果 | 第41-45页 |
| 1.包涵体的纯化 | 第41-43页 |
| ·包涵体的提取和初步洗涤 | 第41页 |
| ·包涵体的复性 | 第41-42页 |
| ·稀释复性 | 第41-42页 |
| ·透析复性 | 第42页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| ·GST亲和层析 | 第42-43页 |
| ·离子交换层析 | 第43页 |
| ·割胶回收 | 第43页 |
| 2.GST-OMP31、GST－OMP10、GST－26表达产物血清学鉴定 | 第43-45页 |
| ·ELISA | 第43-44页 |
| ·western-blot | 第44-45页 |
| 3.多抗制备及鉴定 | 第45页 |
| 五、讨论 | 第45-49页 |
| 包涵体的纯化和复性 | 第45-47页 |
| 重组表达蛋白的免疫血清鉴定 | 第47-49页 |
| 小结 | 第49-50页 |
| 第三部分 重组布鲁氏菌外膜蛋白OMP31和bp26在小鼠体内免疫应答研究 | 第50-69页 |
| 一、材料 | 第50页 |
| 1.试剂 | 第50页 |
| 2.动物 | 第50页 |
| 3.主要仪器 | 第50页 |
| 二、方法 | 第50-52页 |
| 1.动物分组与免役 | 第50-51页 |
| 2.免疫原性分析 | 第51-52页 |
| ·特异性抗体的的检测 | 第51页 |
| ·淋巴细胞增殖实验(MTT法) | 第51-52页 |
| ·淋巴细胞亚群分析 | 第52页 |
| ·细胞因子ELISA检测 | 第52页 |
| ·迟发性超敏反应(DTH) | 第52页 |
| 3.统计学处理 | 第52页 |
| 三、结果 | 第52-62页 |
| 1.特异性IgG抗体检测结果 | 第52-53页 |
| 2.淋巴细胞增殖试验结果 | 第53-55页 |
| 3.免疫小鼠淋巴细胞亚群的分析结果 | 第55-59页 |
| ·第6周CD4+/CD8+T细胞比值的结果 | 第55-56页 |
| ·第6周CD4~+、CDS~+T细胞的计数结果: | 第56页 |
| ·第6周CD86~+T细胞计数结果: | 第56页 |
| ·免疫后第10周CD4~+/CDS~+T细胞比值的结果: | 第56页 |
| ·免疫后第10周CD4~+、CD8~+T细胞的计数结果: | 第56页 |
| ·免疫后第10周CD86~+T细胞计数结果: | 第56-57页 |
| ·GST-OMP31和GST-bP26组间比较: | 第57-59页 |
| 4 免疫小鼠细胞因子水平的检测 | 第59-61页 |
| ·免疫后第6周细胞因子水平检测结果: | 第59页 |
| ·免疫后第10周细胞因子水平检测结果: | 第59页 |
| ·GST-OMP31和GST-bp26细胞因子水平组间比较: | 第59-61页 |
| 4.DTH反应结果 | 第61-62页 |
| 四、讨论: | 第62-68页 |
| 1.融合蛋白GST-OMP31和GST-bp26诱导产生特异性体液免疫 | 第62-63页 |
| 2.融合蛋白GST-OMP31和GST-bp26诱导产生淋巴细胞增殖 | 第63-65页 |
| 3.融合蛋白GST-OMP31和GST-bp26诱导的细胞因子水平变化 | 第65-66页 |
| 4.OMP31和bp26免疫效果的比较 | 第66-68页 |
| 小结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-76页 |
| 附录一 | 第76-91页 |
| 附录二 | 第91-93页 |
| 硕士期间论文发表情况 | 第93-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 原创性声明及版权使用授权说明 | 第95页 |
