| 缩略词表 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 前言 | 第12-22页 |
| 1. DNA解旋酶概述 | 第12-14页 |
| 1.1 DNA解旋酶的分类 | 第12-13页 |
| 1.2 DNA解旋酶的生化活性及功能 | 第13-14页 |
| 1.2.1 核酸结合活性 | 第13页 |
| 1.2.2 NTP结合与水解活性 | 第13页 |
| 1.2.3 解链活性 | 第13-14页 |
| 1.2.4 退火活性 | 第14页 |
| 1.2.5 DNA解旋酶的的功能 | 第14页 |
| 2.RecQ解旋酶的的结构与功能 | 第14-15页 |
| 3.BLM解旋酶的研究进展 | 第15-17页 |
| 3.1 BLM解旋酶的结构 | 第15-16页 |
| 3.2 BLM解旋酶的功能 | 第16页 |
| 3.3 与BLM解旋酶相关的疾病研究 | 第16-17页 |
| 4.人类前列腺癌的发生与BLM解旋酶作为抗癌靶标的研究 | 第17页 |
| 5.CRISPR/Cas9技术的应用 | 第17-20页 |
| 5.1 CRISPR/Cas9技术的出现及发展 | 第17-18页 |
| 5.2 CRISPR/Cas系统结构与特征 | 第18-19页 |
| 5.3 CRISPR/Cas系统工作原理 | 第19-20页 |
| 5.4 CRISPR/Cas9的应用 | 第20页 |
| 5.5 CRISPR/Cas9系统可能存在的问题 | 第20页 |
| 6.目的及研究意义 | 第20-22页 |
| 第二章 BLM解旋酶基因Cas9载体的构建与鉴定 | 第22-28页 |
| 1.实验材料 | 第22-23页 |
| 1.1 试剂材料 | 第22页 |
| 1.2 试剂配制 | 第22-23页 |
| 1.3 主要仪器 | 第23页 |
| 2.实验方法 | 第23-25页 |
| 2.1 BLM基因靶位点设计与合成 | 第23-24页 |
| 2.2 感受态细胞的制备 | 第24页 |
| 2.3 载体的克隆转化 | 第24-25页 |
| 2.4 阳性菌落的挑取与培养 | 第25页 |
| 2.5 质粒少量提取 | 第25页 |
| 2.6 质粒的鉴定 | 第25页 |
| 3.结果与分析 | 第25-27页 |
| 3.1 gRNA的序列设计 | 第25页 |
| 3.2 重组载体克隆后鉴定 | 第25-26页 |
| 3.3 重组载体测序结果 | 第26-27页 |
| 4. 讨论 | 第27-28页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9载体转染PC3细胞及活性分析 | 第28-38页 |
| 1.实验材料 | 第28-29页 |
| 1.1 试验材料 | 第28页 |
| 1.2 试剂配制 | 第28-29页 |
| 1.3 主要仪器 | 第29页 |
| 2.实验方法 | 第29-34页 |
| 2.1 PC3细胞的培养 | 第29-30页 |
| 2.2 无内毒素质粒的提取 | 第30页 |
| 2.3 重组载体转染PC3细胞 | 第30-31页 |
| 2.4 嘌呤霉素对PC3细胞的最小致死量筛选 | 第31页 |
| 2.5 CRISPR/Cas9打靶载体的活性检测 | 第31-32页 |
| 2.5.1 细胞基因组DNA提取 | 第31-32页 |
| 2.5.2 PCR, T7E1实验 | 第32页 |
| 2.6 Donor载体的构建 | 第32-33页 |
| 2.7 混合细胞系的获得 | 第33页 |
| 2.8 有限稀释法制备单细胞克隆 | 第33-34页 |
| 3.结果与分析 | 第34-37页 |
| 3.1 重组载体转染PC3细胞 | 第34页 |
| 3.2 T7引物的检测 | 第34-35页 |
| 3.3 T7错配酶检测 | 第35页 |
| 3.4 Donor载体测序结果 | 第35-36页 |
| 3.5 混合细胞的获得 | 第36页 |
| 3.6 单克隆的生长和扩大培养 | 第36-37页 |
| 4.讨论 | 第37-38页 |
| 第四章 敲除BLM解旋酶基因后对PC3细胞活性的影响 | 第38-44页 |
| 1.实验材料 | 第38-39页 |
| 1.1 试剂材料 | 第38页 |
| 1.2 试剂配制 | 第38-39页 |
| 1.3 主要仪器 | 第39页 |
| 2.实验方法 | 第39-41页 |
| 2.1 PC3细胞的培养 | 第39页 |
| 2.2 重组载体转染PC3细胞及抗性筛选 | 第39页 |
| 2.3 PC3细胞增殖能力的检测 | 第39页 |
| 2.4 PC3细胞侵袭能力的检测 | 第39-40页 |
| 2.5 PC3细胞迁移能力的检测 | 第40页 |
| 2.6 PC3细胞凋亡能力的检测 | 第40-41页 |
| 2.7 统计学处理 | 第41页 |
| 3.实验结果 | 第41-42页 |
| 3.1 PC3细胞增殖能力的变化 | 第41页 |
| 3.2 PC3细胞侵袭能力的变化 | 第41页 |
| 3.3 PC3细胞迁移能力的变化 | 第41-42页 |
| 3.4 PC3细胞凋亡能力的变化 | 第42页 |
| 4.讨论 | 第42-44页 |
| 第五章 敲减BLM解旋酶表达增强PC3细胞对丝裂霉素C的敏感性 | 第44-54页 |
| 1.实验材料 | 第44页 |
| 1.1 试剂材料 | 第44页 |
| 1.2 试剂配制 | 第44页 |
| 1.3 主要仪器 | 第44页 |
| 2.实验方法 | 第44-47页 |
| 2.1 重组载体转染PC3细胞及药物试验 | 第45页 |
| 2.2 转染重组载体后PC3细胞总RNA的提取与RNA的反转录 | 第45页 |
| 2.3 MTT法检测转染后细胞增殖能力 | 第45-46页 |
| 2.4 Transwell小室检测细胞侵袭能力 | 第46页 |
| 2.5 细胞划痕实验 | 第46页 |
| 2.6 流式细胞检测细胞凋亡 | 第46-47页 |
| 2.7 统计学处理 | 第47页 |
| 3.结果与分析 | 第47-52页 |
| 3.1 细胞转染效率 | 第47页 |
| 3.2 cDNA质量及实时荧光定量PCR引物特异性检测 | 第47-48页 |
| 3.3 各试验组转染细胞后mRNA水平的变化 | 第48-49页 |
| 3.4 PC3细胞增殖能力的变化 | 第49页 |
| 3.5 PC3细胞侵袭能力的变化 | 第49-50页 |
| 3.6 PC3细胞迁移能力的变化 | 第50-51页 |
| 3.7 PC3细胞凋亡能力的变化 | 第51-52页 |
| 4.讨论 | 第52-54页 |
| 第六章 结论与展望 | 第54-55页 |
| 6.1 结论 | 第54页 |
| 6.2 展望 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 附录 | 第63-64页 |
