| 中文摘要 | 第1-10页 |
| 英文摘要 | 第10-14页 |
| 前言 | 第14-26页 |
| 第一部分：反转录病毒载体介导的转移的人β-珠蛋白基因在MEL细胞中的整合与表达 | 第26-67页 |
| 材料与方法 | 第26-42页 |
| 一.实验材料 | 第26-27页 |
| 1.菌株与质粒 | 第26页 |
| 2.细胞系 | 第26页 |
| 3.限制性内切酶及修饰酶 | 第26页 |
| 4.其他主要试剂 | 第26-27页 |
| 5.主要仪器 | 第27页 |
| 6.放射性核素 | 第27页 |
| 二.实验方法 | 第27-42页 |
| 1.反转录病毒载体介导的人β-珠蛋白基因转移的基本路线 | 第27页 |
| 2.人β-珠蛋白基因反转录病毒载体的设计与构建 | 第27-34页 |
| ·聚乙二醇(PEG)法回收DNA片段 | 第29页 |
| ·DNA片段3’端凹陷的补平 | 第29-30页 |
| ·DNA片段3’端突出的削平 | 第30页 |
| ·载体的脱磷酸化 | 第30-31页 |
| ·连接反应 | 第31页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第31页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第31页 |
| ·感受态细胞的快速转化 | 第31页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第31-32页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第32页 |
| ·PCR引物及反应条件 | 第32-33页 |
| ·荧光测序 | 第33页 |
| ·细胞培养 | 第33页 |
| ·G418溶液配制 | 第33页 |
| ·细胞的传代及冻存 | 第33-34页 |
| ·细胞复苏 | 第34页 |
| 4.产病毒细胞系的建立 | 第34-36页 |
| ·人β-珠蛋白基因反转录病毒重组体转染双向性包装细胞系PA317 | 第34-35页 |
| ·PA317细胞出芽的病毒颗粒转导单向性包装细胞系Ψ2 | 第35页 |
| ·Ψ2产病毒细胞系的扩增、冻存及病毒上清收集 | 第35页 |
| ·病毒生物学滴度的传统方法测定 | 第35页 |
| ·病毒生物学滴度的简单方法测定 | 第35-36页 |
| 5.重组反转录病毒的瞬时包装与纯化 | 第36页 |
| ·人β-珠蛋白基因反转录病毒重组体转染双向性包装细胞系ΨA | 第36页 |
| ·重组病毒的大量制备与纯化 | 第36页 |
| 6.前病毒DNA结构分析 | 第36-38页 |
| ·从产病毒细胞系及感染细胞中提取基因组DNA | 第36页 |
| ·Southern印迹分析 | 第36-38页 |
| ·酶解 | 第36-37页 |
| ·电泳 | 第37页 |
| ·Southern转膜 | 第37页 |
| ·预杂交 | 第37页 |
| ·DNA探针标记 | 第37-38页 |
| ·杂交 | 第38页 |
| ·洗膜及放射自显影 | 第38页 |
| 7.用含人β珠蛋白基因的重组反转录病毒转导MEL细胞 | 第38-39页 |
| ·收集病毒上清 | 第38页 |
| ·病毒转导MEL细胞 | 第38-39页 |
| 8.DMSO诱导MEL细胞分化 | 第39页 |
| 9.RNase保护实验检测人β-珠蛋白基因的表达水平 | 第39-42页 |
| ·从病毒转导MEL细胞中提取细胞总RNA | 第39页 |
| ·RNase保护实验 | 第39-42页 |
| ·RNA探针标记 | 第39-40页 |
| ·RNA探针纯化 | 第40-41页 |
| ·RNA：RNA杂交 | 第41页 |
| ·RNase反应,变性胶电泳及放射自显影 | 第41-42页 |
| 实验结果 | 第42-67页 |
| 一.β珠蛋白基因反转录病毒重组体的构建 | 第42-53页 |
| 1.β珠蛋白基因反转录病毒重组体构建的总体策略 | 第42-43页 |
| ·基因座控制区DNase Ⅰ高敏位点片段的选择 | 第42页 |
| ·结构基因的选择 | 第42-43页 |
| ·调控序列和结构基因在GlNa载体中的方向 | 第43页 |
| 2.β珠蛋白基因反转录病毒重组体的构建 | 第43-50页 |
| ·携带单一DNase Ⅰ高敏位点片段的人β-珠蛋白基因反转录病毒重组体的构建 | 第43-45页 |
| ·携带2.3kb mini LCR (HS32)的人β-珠蛋白基因反转录病毒重组体的构建 | 第45-47页 |
| ·携带1.1kb mini LCR (HS32、HS42)的人β-珠蛋白基因反转录病毒重组体的构建 | 第47-50页 |
| ·用PCR方法鉴定六种不同重组体 | 第50页 |
| 3.六种不同重组体的特性概括 | 第50-53页 |
| 二、产β-珠蛋白基因反转录病毒细胞系的建立以及病毒滴度的测定 | 第53-58页 |
| 1.Ψ2产病毒细胞系中前病毒DNA结构 | 第53-57页 |
| 2.重组病毒滴度的测定 | 第57-58页 |
| 三、人β-珠蛋白基因反转录病毒重组体在病毒转导MEL细胞中的整合 | 第58-60页 |
| 四、人β-珠蛋白基因在病毒转导MEL细胞中的表达 | 第60-63页 |
| 五、GlNaHS32△β2.0,(1.1kb)前病毒的结构分析 | 第63-67页 |
| 1.重组体GlNaHS32△β2.0,(1.1kb)在Ψ2产病毒细胞系和MEL细胞中的完整整合以及人β珠蛋白基因在MEL细胞中低水平表达 | 第63页 |
| 2.基因组中前病毒的PCR mapping | 第63页 |
| 3.PCR产物的双向测序 | 第63-67页 |
| 第二部分 腺相关病毒载体介导的间接体内人β-珠蛋白基因转移研究 | 第67-80页 |
| 材料与方法 | 第67-75页 |
| 一、实验材料 | 第67页 |
| 二、实验方法 | 第67-75页 |
| 1.腺相关病毒载体的间接体内人β-珠蛋白基因转移的基本路线 | 第67页 |
| 2.腺相关病毒重组体AV53HS432△β2.0Neo的制备与纯化 | 第67-69页 |
| 3.重组病毒的包装、大量制备与纯化 | 第69-70页 |
| 4.重组病毒的滴度测定 | 第70-71页 |
| 5.小鼠造血细胞的基因转移和骨髓移植 | 第71页 |
| 6.造血重建小鼠中人β-珠蛋白基因的整合与表达 | 第71-75页 |
| 结果 | 第75-80页 |
| 一、重组体AV53HS432△β2.0Neo在BHK-21细胞系中的整合 | 第75-76页 |
| 二、获得高滴度的重组病毒 | 第76页 |
| 三、造血重建小鼠体内人β-珠蛋白基因的检测 | 第76-77页 |
| 四、人β-珠蛋白基因在造血重建小鼠体内的表达 | 第77-80页 |
| 讨论 | 第80-90页 |
| 小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-100页 |
| 文献综述 | 第100-118页 |
| 英文名词及缩写 | 第118-121页 |
| 致谢 | 第121页 |
