| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 1 前言 | 第11-25页 |
| ·结核病与耐多药结核病的发病现状 | 第11-13页 |
| ·DNA旋转酶的研究进展 | 第13-18页 |
| ·DNA旋转酶的生物学意义及在拓扑异构酶分类中的地位 | 第13-14页 |
| ·旋转酶的酶学模型与作用机制 | 第14-16页 |
| ·旋转酶gyrB基因可以作为细菌分类和近缘种鉴定的依据 | 第16页 |
| ·旋转酶作为抗生素的靶标及其耐药性 | 第16-17页 |
| ·问题与展望 | 第17-18页 |
| ·蛋白质与DNA相互作用的研究进展 | 第18-25页 |
| ·体外研究方法 | 第18-23页 |
| ·生物信息学的方法 | 第18-19页 |
| ·凝胶阻滞技术(EMSA) | 第19-20页 |
| ·表面等离子共振(SPR) | 第20-21页 |
| ·荧光共振能量转移(FRET) | 第21-22页 |
| ·DNAse I足迹法(DNAse I Footprinting) | 第22-23页 |
| ·电镜观察复合物(Complex under EM) | 第23页 |
| ·紫外交联法(Cross Linking) | 第23页 |
| ·体内研究方法 | 第23-25页 |
| ·酵母单杂交体系(Yeast-one-hybrid system) | 第23-24页 |
| ·免疫共沉淀(ChIP) | 第24-25页 |
| 2 研究目的与意义 | 第25-26页 |
| 3 材料与方法 | 第26-39页 |
| ·材料 | 第26-30页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·质粒和菌株 | 第26-28页 |
| ·单双链DNA | 第28-29页 |
| ·分子生物学试剂和常用试剂 | 第29页 |
| ·实验仪器 | 第29-30页 |
| ·方法 | 第30-39页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体的构建 | 第30-35页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基突变体基因片段的PCR扩增 | 第30-32页 |
| ·PCR产物/酶切产物的回收和纯化 | 第32-33页 |
| ·质粒的提取 | 第33-34页 |
| ·大肠杆菌BL21感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第34页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第34页 |
| ·连接产物的转化 | 第34-35页 |
| ·重组子的筛选和验证 | 第35页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体蛋白的表达与纯化 | 第35-37页 |
| ·蛋白的小量诱导表达 | 第35页 |
| ·蛋白的大量表达与纯化 | 第35-37页 |
| ·蛋白纯化缓冲液及SDS-PAGE电泳缓冲液 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第37-38页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第38页 |
| ·分析结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体蛋白与DNA相互作用的EMSA 试验 | 第38-39页 |
| 4 结果与分析 | 第39-56页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体的构建 | 第39-42页 |
| ·缺失突变体pET28a-gyrB_(278-714)和pET28a-gyrB_(1-631)表达载体的单双酶切验证 | 第39-40页 |
| ·缺失突变体pET28a-gyrB_(463-714)表达载体的单双酶切验证 | 第40-41页 |
| ·缺失突变体pET28a-gyrB_(1-542),pET28a-gyrB_(1-519),pET28a-gyrB_(1-500)和pET28a-gyrB_(1-482)单双酶切验证 | 第41-42页 |
| ·缺失突变体pET28a-gyrB_(1-270),pET28a-gyrB_(271-480)和pET28a-gyrB_(485-714)的双酶切验证 | 第42页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体亚蛋白的表达与纯化 | 第42-48页 |
| ·GyrA亚基全长蛋白的表达和纯化 | 第43页 |
| ·GyrB亚基全长蛋白的表达和纯化 | 第43-44页 |
| ·GyrB_(278-714)亚蛋白的表达与纯化 | 第44页 |
| ·GyrB_(1-631)亚蛋白的表达和纯化 | 第44-45页 |
| ·GyrB_(1-462)亚蛋白的表达和纯化 | 第45页 |
| ·GyrB_(463-714)亚蛋白的表达和纯化 | 第45-46页 |
| ·GyrB_(1-482)亚蛋白的表达和纯化 | 第46页 |
| ·GyrB_(ΔToprim)亚蛋白的表达和纯化 | 第46-47页 |
| ·GyrB_(1-564)亚蛋白的表达和纯化 | 第47页 |
| ·GyEB_(1-542),GyrB_(1-519),GyrB_(1_500)和GyrB_(1-482)亚蛋白的表达 | 第47-48页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体与DNA相互作用的EMSA试验 | 第48-56页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体与单链DNA的相互作用 | 第48-51页 |
| ·B亚基全长与单链DNA的结合特性 | 第48页 |
| ·GyrB_(1-462)与单链DNA的结合特性 | 第48-49页 |
| ·GyrB_(1-482)与单链DNA的结合特性 | 第49-50页 |
| ·GyrB_(463-714)与单链DNA的结合特性 | 第50页 |
| ·GyrB_(278-714)与单链DNA的结合特性 | 第50-51页 |
| ·GyrB_(1-631)与单链DNA的结合特性 | 第51页 |
| ·结核分枝杆菌旋转酶B亚基缺失突变体与双链DNA的相互作用 | 第51-56页 |
| ·B亚基全长与双链DNA的结合特性 | 第51-52页 |
| ·GyrB_(1-462)与双链DNA的结合特性 | 第52-53页 |
| ·GyrB_(1-482)与双链DNA的结合特性 | 第53页 |
| ·GyrB_(278-714)与双链DNA的结合特性 | 第53-54页 |
| ·GyrB_(1-631)与双链DNA的结合特性 | 第54页 |
| ·GyrB_(1-564)与双链DNA的结合特性 | 第54-55页 |
| ·GyrB_(463-714)与双链DNA的结合特性 | 第55-56页 |
| ·GyrB_(Δ-Toprim)与双链DNA的结合特性 | 第56页 |
| 5 讨论 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 附录 | 第64-65页 |
