| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 缩略词表 | 第6-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-28页 |
| 1.1 抗感染治疗发展现状 | 第10-11页 |
| 1.2 菌体的理性工程改造方法 | 第11-13页 |
| 1.2.1 进化工程改造 | 第11-12页 |
| 1.2.2 代谢工程改造 | 第12-13页 |
| 1.3 放线菌中次生代谢产物的合成及代谢工程改造 | 第13-17页 |
| 1.3.1 改变前体供应 | 第13-14页 |
| 1.3.2 改变次生代谢途径的调控网络 | 第14-15页 |
| 1.3.3 改变次生代谢产物合成的结构基因 | 第15-16页 |
| 1.3.4 异源表达次生代谢产物合成的整个基因簇 | 第16-17页 |
| 1.4 杰多霉素综述 | 第17-24页 |
| 1.4.1 链霉菌概述 | 第17-20页 |
| 1.4.2 杰多霉素概述 | 第20-21页 |
| 1.4.3 杰多霉素的生物合成途径及生物合成基因簇简介 | 第21-24页 |
| 1.5 杰多霉素jadL基因和头霉素C合成簇内cmct基因概述 | 第24-26页 |
| 1.5.1 泵的分类及应用 | 第24页 |
| 1.5.2 MFS家族杰多霉素生物合成簇内jadL基因概述 | 第24-25页 |
| 1.5.3 棒状链霉菌NRRL 3585的cmcT基因概述 | 第25-26页 |
| 1.6 应用诱导型启动子biosensor工程改造菌体策略 | 第26页 |
| 1.7 论文主要内容和意义 | 第26-28页 |
| 第二章 杰多霉素jadL功能分析及其对委内瑞拉链霉菌表型影响 | 第28-48页 |
| 2.1 前言 | 第28-29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-35页 |
| 2.2.1 菌株、质粒及引物 | 第29-32页 |
| 2.2.2 培养基 | 第32-33页 |
| 2.2.3 实验试剂及缓冲液 | 第33-34页 |
| 2.2.4 实验试剂及仪器 | 第34-35页 |
| 2.3 实验方法 | 第35-41页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第35-36页 |
| 2.3.2 碱裂解法提取大肠杆菌质粒 | 第36页 |
| 2.3.3 链霉菌总DNA的小量制备 | 第36-37页 |
| 2.3.4 委内瑞拉链霉菌培养条件 | 第37页 |
| 2.3.5 链霉菌-大肠杆菌间的接合转移 | 第37-38页 |
| 2.3.6 发酵液预处理 | 第38页 |
| 2.3.7 高效液相色谱(HPLC)检测 | 第38页 |
| 2.3.8 质谱(MS)分析 | 第38页 |
| 2.3.9 PCR产物鉴定-琼脂糖凝胶电泳 | 第38页 |
| 2.3.10 使用Gel extraction kit(OMIGA)回收目的DNA片段 | 第38-39页 |
| 2.3.11 菌种保存 | 第39页 |
| 2.3.12 DNA测序 | 第39页 |
| 2.3.13 用于jadL敲除质粒的构建 | 第39页 |
| 2.3.14 jadL缺失株的构建 | 第39-40页 |
| 2.3.15 jadL回补质粒的构建 | 第40页 |
| 2.3.16 jadL回补株LDCOM和过表达株LOE的构建 | 第40页 |
| 2.3.17 杰多霉素生物合成基因簇缺失株WVR2006的构建 | 第40页 |
| 2.3.18 细胞内与细胞外检测杰多霉素B方法 | 第40-41页 |
| 2.3.19 菌体生长测定法 | 第41页 |
| 2.4 结果与分析 | 第41-48页 |
| 2.4.1 jadL失活菌株削弱菌体生长、降低杰多霉素B产量 | 第41-43页 |
| 2.4.2 回补jadL或者敲除jad合成全簇基因都可以使菌体重获生长能力 | 第43-46页 |
| 2.4.3 过表达jadL可以提高杰多霉素产量并且提高自身抗性 | 第46-48页 |
| 第三章 操作杰多霉素JadL及头霉素C CmcT MFS家族转运蛋白对抗生素产量影响 | 第48-53页 |
| 3.1 前言(如前2.1) | 第48页 |
| 3.2 实验材料及仪器(同前) | 第48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48-49页 |
| 3.3.1 杰多霉素毒理耐受性分析方法 | 第48页 |
| 3.3.2 jadL回补到WVR2006菌株中获得了WVR2006L | 第48页 |
| 3.3.3 外源加入杰多霉素B运输方向分析 | 第48页 |
| 3.3.4 生物信息学分析方法 | 第48-49页 |
| 3.3.5 头霉素C合成途径cmcT基因过表达质粒的构建 | 第49页 |
| 3.3.6 构建棒状链霉菌cmcT过表达株TOE | 第49页 |
| 3.3.7 高效液相色谱检测头霉素C方法 | 第49页 |
| 3.4 结果与分析 | 第49-53页 |
| 3.4.1 杰多霉素毒理耐受性分析 | 第49-50页 |
| 3.4.2 外源加入Jd B对WVR2006和WVR2006L泵出分析 | 第50-51页 |
| 3.4.3 过表达CmcT提高棒状链霉菌NRRL3585头霉素C产量 | 第51-53页 |
| 第四章 设计和构建biosensor模型筛选新的调控蛋白 | 第53-65页 |
| 4.1 前言 | 第53页 |
| 4.2 实验材料(见材料2.2.1) | 第53页 |
| 4.3 实验方法 | 第53-59页 |
| 4.3.0 xyIE-neo双报告系统及相关质粒 | 第53页 |
| 4.3.1 几种biosensor载体和重组菌株的构建 | 第53-54页 |
| 4.3.2 XyIE活性的定性和定量检测 | 第54-55页 |
| 4.3.3 生物活性实验检测 | 第55页 |
| 4.3.4 菌体的培养与CrpA和CrpB的诱导表达 | 第55页 |
| 4.3.5 蛋白粗酶液的获得 | 第55页 |
| 4.3.6 蛋白的SDS-PAGE检测 | 第55-56页 |
| 4.3.7 Ni亲和柱层析 | 第56页 |
| 4.3.8 Bradford法测定蛋白的浓度 | 第56-57页 |
| 4.3.9 酶标仪测定酶活力曲线方法 | 第57页 |
| 4.3.10 EMSA探针制备 | 第57页 |
| 4.3.11 EMSA胶的制备,电泳及显影 | 第57-59页 |
| 4.4 结果与分析 | 第59-65页 |
| 4.4.1 对诱导启动子biosensor适配性的初步检测 | 第59-61页 |
| 4.4.2 抑制子模型和去抑制子模型biosensor灵敏性初探 | 第61-63页 |
| 4.4.3 利用诱导型biosensor钓取抑制蛋白 | 第63-64页 |
| 4.4.4 对筛选的蛋白进行体外EMSA验证 | 第64-65页 |
| 第五章 讨论 | 第65-69页 |
| 5.1 对MFS家族转运蛋白JadL部分的讨论 | 第65-66页 |
| 5.2 对biosensor筛选调控基因方法的讨论 | 第66-67页 |
| 5.3 以合成生物学为落脚点理性改造菌株 | 第67-69页 |
| 第六章 结论 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 在学期间已发表的研究成果 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 附录：扫描电镜图 | 第78页 |
