| 致谢 | 第4-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-22页 |
| 1.1 甾体化合物概述 | 第11-13页 |
| 1.1.1 甾体化合物的结构与分类 | 第11-12页 |
| 1.1.2 甾体化合物的应用 | 第12页 |
| 1.1.3 主要的甾体激素类药物 | 第12-13页 |
| 1.2 甾体化合物的合成 | 第13-16页 |
| 1.2.1 甾体化合物的化学合成 | 第13-14页 |
| 1.2.2 甾体化合物的微生物转化 | 第14-16页 |
| 1.2.2.1 甾体化合物微生物转化的发展历史 | 第14-15页 |
| 1.2.2.2 甾体化合物微生物转化的特点 | 第15页 |
| 1.2.2.3 甾体化合物微生物转化的反应类型 | 第15-16页 |
| 1.3 甾体C11α-羟基化反应 | 第16-20页 |
| 1.3.1 甾体C11α-羟基化反应的微生物 | 第16-17页 |
| 1.3.2 甾体C11α-羟基化反应的微生物转化方法 | 第17页 |
| 1.3.3 甾体C11α-羟基化反应机理 | 第17-18页 |
| 1.3.4 甾体羟基化反应的主要影响因素和转化工艺 | 第18-19页 |
| 1.3.5 甾体C11α-羟基化反应研究进展 | 第19-20页 |
| 1.4 本论文研究的背景和主要内容 | 第20-22页 |
| 1.4.1 甾体药物工业生产的现状和发展趋势 | 第20-21页 |
| 1.4.2 利华制药厂的生产状况 | 第21页 |
| 1.4.3 本研究选取的研究对象 | 第21页 |
| 1.4.4 主要研究方法和内容 | 第21-22页 |
| 第二章 米根霉中CYP和CPR基因的获取及分析 | 第22-38页 |
| 2.1 材料和方法 | 第22-28页 |
| 2.1.1 材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1.1 菌种 | 第22页 |
| 2.1.1.2 培养基的配置和缓冲液的配置 | 第22页 |
| 2.1.1.3 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.1.4 仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.2 CYP和CPR DNA序列的获取 | 第23-25页 |
| 2.1.2.1 引物的设计 | 第23页 |
| 2.1.2.2 米根霉DNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.1.2.3 CYP和CPR的PCR扩增 | 第24页 |
| 2.1.2.4 PCR产物回收及测序 | 第24-25页 |
| 2.1.3 CYP和CPR编码序列的获取 | 第25-28页 |
| 2.1.3.1 引物的设计 | 第25页 |
| 2.1.3.2 米根霉总RNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.1.3.3 cDNA第一条链的合成 | 第26页 |
| 2.1.3.4 CYP和CPR的RT-PCR | 第26-27页 |
| 2.1.3.5 CYP和CPR与T载体的酶连和转化 | 第27-28页 |
| 2.1.3.6 重组质粒的提取 | 第28页 |
| 2.2 结果与分析 | 第28-37页 |
| 2.2.1 CYP和CPR的DNA序列分析 | 第28-32页 |
| 2.2.1.1 CYP和CPR的PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.1.2 CYP和CPR的DNA序列分析 | 第29-32页 |
| 2.2.2 CYP和CPR的编码序列的分析 | 第32-37页 |
| 2.2.2.1 CYP和CPR的RT-PCR | 第32-33页 |
| 2.2.2.2 CYP和CPR测序质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.2.3 CYP和CPR的编码序列分析 | 第34-37页 |
| 2.3 本章小结 | 第37-38页 |
| 第三章 CYP和CPR表达载体的构建 | 第38-44页 |
| 3.1 材料和方法 | 第38-41页 |
| 3.1.1 材料 | 第38页 |
| 3.1.1.1 菌种和质粒 | 第38页 |
| 3.1.1.2 培养基的配置 | 第38页 |
| 3.1.1.3 主要试剂 | 第38页 |
| 3.1.1.4 仪器 | 第38页 |
| 3.1.2 CYP绿色荧光融合表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 3.1.2.1 构建策略 | 第38页 |
| 3.1.2.2 pEGFP-C1和CYPT1的双酶切及酶连转化 | 第38-39页 |
| 3.1.2.3 转化子的挑取和重组质粒的提取、鉴定和测序 | 第39页 |
| 3.1.3 CYP单独表达载体的构建 | 第39-40页 |
| 3.1.3.1 构建策略 | 第39页 |
| 3.1.3.2 引物设计及RT-PCR扩增 | 第39页 |
| 3.1.3.3 CYPT2的获取 | 第39页 |
| 3.1.3.4 pC1-CYP重组载体的构建 | 第39-40页 |
| 3.1.4 CPR单独表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 3.1.4.1 构建策略 | 第40页 |
| 3.1.4.2 引物设计和PCR扩增 | 第40页 |
| 3.1.4.3 DNA multimer产物的获得 | 第40-41页 |
| 3.1.4.4 pC1-CPR重组载体的构建 | 第41页 |
| 3.2 结果和分析 | 第41-43页 |
| 3.2.1 CYP绿色荧光融合表达载体的构建结果分析 | 第41-42页 |
| 3.2.2 CYP单独表达载体的构建结果分析 | 第42页 |
| 3.2.3 RoCPR1单独表达载体的构建结果分析 | 第42-43页 |
| 3.3 本章小结 | 第43-44页 |
| 第四章 表达载体转化黑根霉LH 21 | 第44-49页 |
| 4.1 材料和方法 | 第44-45页 |
| 4.1.1 材料 | 第44页 |
| 4.1.1.1 菌种和质粒 | 第44页 |
| 4.1.1.2 培养基的配置 | 第44页 |
| 4.1.1.3 主要试剂 | 第44页 |
| 4.1.1.4 仪器 | 第44页 |
| 4.1.2 脂质体介导法转化黑根霉 | 第44-45页 |
| 4.1.2.1 pEGFP-CYP转化黑根霉LH 21 | 第44页 |
| 4.1.2.2 传代培养 | 第44页 |
| 4.1.2.3 转化子的荧光检测 | 第44-45页 |
| 4.1.2.4 转化子的PCR鉴定 | 第45页 |
| 4.1.2.5 pC1-CYP转化黑根霉LH 21 | 第45页 |
| 4.1.2.6 pC1-CPR转化黑根霉LH 21 | 第45页 |
| 4.2 结果与分析 | 第45-48页 |
| 4.2.1 G418浓度的确定 | 第45页 |
| 4.2.2 pEGFP-CYP转化子的鉴定 | 第45-46页 |
| 4.2.3 CYP转化子的鉴定 | 第46-47页 |
| 4.2.4 CPR转化子的鉴定 | 第47-48页 |
| 4.3 本章小结 | 第48-49页 |
| 第五章 转化子的C11α-羟基化转化率测定 | 第49-56页 |
| 5.1 材料和方法 | 第49-50页 |
| 5.1.1 材料 | 第49页 |
| 5.1.1.1 菌种 | 第49页 |
| 5.1.1.2 培养基的配置 | 第49页 |
| 5.1.1.3 主要试剂 | 第49页 |
| 5.1.1.4 仪器 | 第49页 |
| 5.1.2 转化子对沃氏氧化物的耐受性 | 第49页 |
| 5.1.3 CYP转化子的半定量 | 第49页 |
| 5.1.4 C11α羟基化转化率测定 | 第49-50页 |
| 5.1.4.1 摇瓶培养条件 | 第49-50页 |
| 5.1.4.2 底物及其投料组成 | 第50页 |
| 5.1.4.3 提取及转化率分析方法 | 第50页 |
| 5.2 结果和分析 | 第50-55页 |
| 5.2.1 转化子的耐受性分析 | 第50-51页 |
| 5.2.2 CYP转化子的半定量 | 第51页 |
| 5.2.3 第一批转化子的测定结果与分析 | 第51-52页 |
| 5.2.4 第二批转化子的测定结果与分析 | 第52-53页 |
| 5.2.5 第三批转化子的测定结果与分析 | 第53-54页 |
| 5.2.6 第四批转化子的测定结果与分析 | 第54-55页 |
| 5.3 本章小结 | 第55-56页 |
| 第六章 结论与讨论 | 第56-59页 |
| 6.1 主要结论 | 第56页 |
| 6.1.1 表达载体的构建 | 第56页 |
| 6.1.2 表达载体转化黑根霉LH 21 | 第56页 |
| 6.1.3 转化子的转化效果分析 | 第56页 |
| 6.2 讨论 | 第56-59页 |
| 6.2.1 黑根霉的羟基化酶系 | 第56-57页 |
| 6.2.2 C11α-羟基化转化率的测定 | 第57页 |
| 6.2.3 脂质体介导法机理的探讨 | 第57-58页 |
| 6.2.4 溶氧对转化率的影响 | 第58页 |
| 6.2.5 培养基成分对转化率的影响 | 第58页 |
| 6.2.6 底物物理状态和预诱导剂对转化率的影响 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-65页 |
| ABSTRACT | 第65页 |
