| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 引言 | 第12-14页 |
| 第一部分 肺炎克雷伯菌 MDH NASBA 扩增方法的建立 | 第14-32页 |
| 1 材料 | 第14-15页 |
| 1.1 菌株 | 第14页 |
| 1.2 主要仪器及耗材 | 第14页 |
| 1.3 主要试剂及配制方法 | 第14-15页 |
| 1.3.1 主要试剂 | 第14-15页 |
| 1.3.2 培养基配制 | 第15页 |
| 1.3.3 NASBA 扩增试剂配制 | 第15页 |
| 2 方法 | 第15-19页 |
| 2.1 NASBA 扩增 | 第15-17页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第15-16页 |
| 2.1.2 提取细菌 RNA | 第16页 |
| 2.1.3 NASBA 扩增 | 第16-17页 |
| 2.2 NASBA 扩增产物的鉴定 | 第17页 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定 NASBA 扩增产物 | 第17页 |
| 2.2.2 NASBA 扩增产物核苷酸测序、分析 | 第17页 |
| 2.3 NASBA 扩增条件的优化 | 第17-19页 |
| 2.3.1 NASBA 扩增反应温度的优化 | 第18页 |
| 2.3.2 NASBA 扩增时间的选择 | 第18页 |
| 2.3.3 NASBA 扩增酶浓度的优化 | 第18页 |
| 2.3.3.1 NASBA 扩增 T7 RNA 聚合酶最佳反应浓度的选择 | 第18页 |
| 2.3.3.2 NASBA 扩增 RNA 酶 H 最佳反应浓度的选择 | 第18页 |
| 2.3.3.3 NASBA 扩增 AMV 逆转录酶最佳反应浓度的选择 | 第18页 |
| 2.3.4 NASBA 扩增试剂浓度的优化 | 第18-19页 |
| 2.3.4.1 NASBA 扩增氯化钾浓度的优化 | 第18页 |
| 2.3.4.2 NASBA 扩增氯化镁浓度的优化 | 第18-19页 |
| 2.3.4.3 NASBA 扩增 DTT 浓度的优化 | 第19页 |
| 3 结果 | 第19-29页 |
| 3.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定 NASBA 扩增产物 | 第19-20页 |
| 3.2 NASBA 扩增产物测序、分析 | 第20-21页 |
| 3.3 NASBA 扩增反应条件的优化 | 第21-29页 |
| 3.3.1 NASBA 扩增反应温度的筛选 | 第21-22页 |
| 3.3.2 NASBA 扩增时间的选择 | 第22-23页 |
| 3.3.3 NASBA 扩增酶浓度的优化 | 第23-26页 |
| 3.3.4 NASBA 扩增试剂浓度的优化 | 第26-29页 |
| 4 小结与讨论 | 第29-32页 |
| 4.1 初步建立 NASBA 扩增方法 | 第29页 |
| 4.2 NASBA 检测方法的建立 | 第29-30页 |
| 4.3 NASBA 反应条件对扩增效率的影响 | 第30页 |
| 4.4 NASBA 的优势 | 第30-32页 |
| 4.4.1 高特异性 | 第30-31页 |
| 4.4.2 高灵敏度 | 第31页 |
| 4.4.3 高保真度 | 第31页 |
| 4.4.4 应用前景广 | 第31-32页 |
| 第二部分 肺炎克雷伯菌 KPC 的PCR 检测及RT-PCR 检测 | 第32-48页 |
| 1 材料 | 第32-33页 |
| 1.1 菌株 | 第32页 |
| 1.2 主要仪器及耗材 | 第32页 |
| 1.3 主要试剂 | 第32-33页 |
| 2 方法 | 第33-36页 |
| 2.1 药敏分析判断标准 | 第33页 |
| 2.2 PCR 引物设计 | 第33页 |
| 2.3 培养基的制备 | 第33-34页 |
| 2.4 DNA 提取 | 第34页 |
| 2.5 PCR 检测 | 第34-35页 |
| 2.5.1 PCR 反应体系 | 第34-35页 |
| 2.5.2 PCR 反应参数 | 第35页 |
| 2.5.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第35页 |
| 2.6 RNA 提取 | 第35页 |
| 2.7 RT-PCR 检测 | 第35-36页 |
| 2.7.1 RT-PCR 反应体系 | 第35-36页 |
| 2.7.2 RT-PCR 反应条件 | 第36页 |
| 2.7.3 RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测 | 第36页 |
| 2.8 特异性检测 | 第36页 |
| 2.9 灵敏度检测 | 第36页 |
| 3 结果 | 第36-47页 |
| 3.1 药敏分析结果 | 第36页 |
| 3.2 KPC PCR 扩增结果 | 第36-38页 |
| 3.3 KPC RT-PCR 特异性检测 | 第38-39页 |
| 3.4 KPC RT-PCR 灵敏度检测 | 第39-40页 |
| 3.5 KPC RT-PCR 扩增结果 | 第40-47页 |
| 3.5.1 RNA 提取结果 | 第40-42页 |
| 3.5.2 RNA 16s rDNA PCR 结果 | 第42-44页 |
| 3.5.3 cDNA KPC PCR 结果 | 第44-47页 |
| 4 小结与讨论 | 第47-48页 |
| 第三部分 肺炎克雷伯菌 KPC NASBA 检测方法的评价与初步应用 | 第48-64页 |
| 1 材料 | 第48-50页 |
| 1.1 菌株 | 第48页 |
| 1.2 主要仪器及耗材 | 第48页 |
| 1.3 主要试剂 | 第48-49页 |
| 1.4 NASBA 扩增引物设计 | 第49-50页 |
| 2 方法 | 第50-51页 |
| 2.1 NASBA 扩增产物核苷酸测序、分析 | 第50页 |
| 2.2 MDH 基因灵敏度及特异性实验 | 第50-51页 |
| 2.2.1 MDH 基因灵敏度实验 | 第50页 |
| 2.2.2 MDH 基因特异性实验 | 第50-51页 |
| 2.3 KPC 基因灵敏度及特异性实验 | 第51页 |
| 2.3.1 KPC 基因灵敏度实验 | 第51页 |
| 2.3.2 KPC 基因特异性实验 | 第51页 |
| 2.4 NASBA 方法的临床初步应用 | 第51页 |
| 2.5 统计学分析 | 第51页 |
| 3 结果 | 第51-62页 |
| 3.1 NASBA 扩增产物核苷酸测序、分析 | 第51-52页 |
| 3.2 MDH 基因灵敏度及特异性实验 | 第52-54页 |
| 3.2.1 MDH 基因灵敏度实验 | 第52-53页 |
| 3.2.2 MDH 基因特异性实验 | 第53-54页 |
| 3.3 KPC 基因灵敏度及特异性实验 | 第54-56页 |
| 3.3.1 KPC 基因灵敏度实验 | 第54-55页 |
| 3.3.2 KPC 基因特异性实验 | 第55-56页 |
| 3.4 NASBA 方法的临床初步应用 | 第56-62页 |
| 3.4.1 NASBA 扩增结果 | 第56-62页 |
| 4 小结与讨论 | 第62-64页 |
| 结论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-68页 |
| 附录A NASBA 技术在致病菌检测中的应用 | 第68-75页 |
| 参考文献 | 第73-75页 |
| 在学研究成果 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
