| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第1章 前言 | 第10-21页 |
| 1.1 引言 | 第10-11页 |
| 1.2 RPE 的简介 | 第11-12页 |
| 1.2.1 RPE 的结构及功能 | 第11页 |
| 1.2.2 RPE 功能异常相关疾病 | 第11-12页 |
| 1.3 分化及去分化诱导 RPE 的研究 | 第12-14页 |
| 1.3.1 hESCs 定向诱导分化 RPE | 第12页 |
| 1.3.2 重编程 RPE | 第12-14页 |
| 1.3.3 网膜色素上皮细胞去分化及转分化 | 第14页 |
| 1.4 RPE 分化的相关分子机制 | 第14-16页 |
| 1.4.1 细胞因子和化学物质调控 | 第14-15页 |
| 1.4.2 信号通路的调控 | 第15页 |
| 1.4.3 基因表达调控 | 第15-16页 |
| 1.5 miRNA 的介绍 | 第16-21页 |
| 1.5.1 miRNA 生物合成过程 | 第16-17页 |
| 1.5.2 miRNA 对细胞正常生命活动的调控 | 第17页 |
| 1.5.3 miRNA 对肿瘤的调控 | 第17页 |
| 1.5.4 miRNA 对细胞重编程调控 | 第17-19页 |
| 1.5.5 miRNA 在 RPE 研究中的意义 | 第19-21页 |
| 第2章 实验材料 | 第21-27页 |
| 2.1 实验设备和试剂耗材 | 第21-23页 |
| 2.1.1 实验主要设备及器材 | 第21-22页 |
| 2.1.2 试剂耗材 | 第22-23页 |
| 2.1.3 实验抗体总表 | 第23页 |
| 2.2 引物序列 | 第23-25页 |
| 2.2.1 miRNAs 引物 | 第23-24页 |
| 2.2.2 RPE 特异性基因的 PCR 引物 | 第24页 |
| 2.2.3 miR-204 靶基因 3'UTR 区的引物序列 | 第24-25页 |
| 2.3 质粒及载体信息 | 第25页 |
| 2.4 细胞来源 | 第25-26页 |
| 2.5 生物信息学软件分析 | 第26-27页 |
| 第3章 实验方法 | 第27-38页 |
| 3.1 实验设计路线 | 第27-28页 |
| 3.2 候选 miRNAs 的确定 | 第28页 |
| 3.3 细胞的准备 | 第28-31页 |
| 3.3.1 原代 HEF 细胞的制备及培养 | 第28-29页 |
| 3.3.2 MEF 的支原体检测 | 第29-30页 |
| 3.3.3 原代 NPC 细胞的制备及培养 | 第30页 |
| 3.3.4 ARPE-19 和 hfRPE 的培养 | 第30-31页 |
| 3.4 miRNAs 转染 ARPE-19 和 hfRPE | 第31-32页 |
| 3.4.1 miRNA 过表达的影响 | 第31-32页 |
| 3.4.2 miRNA 抑制表达的影响 | 第32页 |
| 3.5 QPCR 分析 | 第32-34页 |
| 3.5.1 细胞总 mRNA 抽提（Takara Trizol 法） | 第32-33页 |
| 3.5.2 去除总 RNA 中的基因组 DNA | 第33页 |
| 3.5.3 Poly（A）加尾反应和反转录反应 | 第33-34页 |
| 3.5.4 Real Time PCR 反应 | 第34页 |
| 3.6 细胞免疫荧光染色 | 第34-35页 |
| 3.7 细胞周期分析 | 第35-36页 |
| 3.7.1 CCK-8 测定 ARPE 和 fRPE 的标准曲线 | 第35页 |
| 3.7.2 CCK-8 测定 ARPE 和 fRPE 的生长曲线 | 第35-36页 |
| 3.7.3 细胞周期检测 | 第36页 |
| 3.8 双荧光素酶报告基因检测 | 第36-37页 |
| 3.8.1 has-miR-204/211 共转染 293FT 细胞 | 第36-37页 |
| 3.8.2 双荧光素酶报告基因检测 | 第37页 |
| 3.9 统计学分析 | 第37-38页 |
| 第4章 结果与分析 | 第38-55页 |
| 4.1 QPCR 检测候选 miRNAs 在不同细胞中的表达 | 第38-39页 |
| 4.2 改变 miR-204/211 的表达水平对 RPE 相关基因的的影响 | 第39-44页 |
| 4.2.1 转染 miR-204/211 mimics 对 ARPE-19/hfRPE 相关基因表达的影响 | 第39-40页 |
| 4.2.2 miRNA mimics 转染 ARPE-19/fRPE 细胞形态变化 | 第40-41页 |
| 4.2.3 miRNA antagomirs 对 ARPE-19/hfRPE 相关基因表达的影响 | 第41-42页 |
| 4.2.4 miRNA antagomirs 转染 ARPE-19/fRPE 细胞形态变化 | 第42-44页 |
| 4.3 免疫荧光检测 miR-204/211 antagomirs 对 RPE 的影响 | 第44-45页 |
| 4.4 cck8 检测两个细胞系的生长曲线 | 第45-52页 |
| 4.4.1 ARPE-19 和 hfRPE 细胞生长曲线的绘制 | 第45页 |
| 4.4.2 miR-204/211 过表达及抑制表达对细胞生长周期的影响 | 第45-52页 |
| 4.5 miR-204/211 靶基因的验证 | 第52-54页 |
| 4.5.1 PCR 扩增候选靶基因的 3'UTR 区序列 | 第52-53页 |
| 4.5.2 psiCHECK-2-3'UTR 的构建 | 第53页 |
| 4.5.3 酶切鉴定 | 第53-54页 |
| 4.6 双荧光素酶标报告基因分析 | 第54-55页 |
| 第5章 讨论 | 第55-59页 |
| 5.1 miRNAs 与 RPE 的相关研究 | 第55-56页 |
| 5.2 miRNA 靶基因预测对实验开展的重要行 | 第56页 |
| 5.3 miRNA 的瞬时调控作用 | 第56-57页 |
| 5.4 细胞周期检测 | 第57页 |
| 5.5 下一步工作计划 | 第57-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-67页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第67页 |
