| 摘要 | 第4-5页 |
| abstract | 第5页 |
| 英文缩写词表 | 第10-12页 |
| 1 引言 | 第12-17页 |
| 1.1 粪肠球菌的概述 | 第12-13页 |
| 1.2 乳腺炎的危害 | 第13页 |
| 1.3 乳腺炎的分类 | 第13-14页 |
| 1.3.1 非临床型乳腺炎 | 第13-14页 |
| 1.3.2 临床型乳腺炎 | 第14页 |
| 1.4 乳腺炎的传染途径 | 第14页 |
| 1.4.1 环境卫生 | 第14页 |
| 1.4.2 加强饲养管理 | 第14页 |
| 1.5 奶牛乳腺炎的预防 | 第14-15页 |
| 1.5.1 正确的挤奶操作 | 第14-15页 |
| 1.5.2 干乳期预防 | 第15页 |
| 1.6 乳腺炎的治疗 | 第15页 |
| 1.6.1 抗生素的治疗 | 第15页 |
| 1.6.2 中药治疗 | 第15页 |
| 1.6.3 疫苗预防 | 第15页 |
| 1.6.4 酶制剂治疗 | 第15页 |
| 1.7 本研究的目的及意义 | 第15-17页 |
| 2 试验材料 | 第17-19页 |
| 2.1 试验材料 | 第17页 |
| 2.2 试验动物 | 第17-18页 |
| 2.3 试验的主要仪器 | 第18-19页 |
| 3 试验方法 | 第19-30页 |
| 3.1 牛乳腺炎粪肠球菌的分离鉴定 | 第19页 |
| 3.1.1 粪肠球菌的分离与培养 | 第19页 |
| 3.1.2 生化试验 | 第19页 |
| 3.1.3 药敏试验 | 第19页 |
| 3.2 制备抗粪肠球菌血清和动物免疫实验 | 第19-20页 |
| 3.2.1 制备抗粪肠球菌血清 | 第19页 |
| 3.2.2 动物免疫实验 | 第19-20页 |
| 3.3 16S rDNA序列鉴定 | 第20-21页 |
| 3.3.1 16S rDNA通用引物的设计 | 第20页 |
| 3.3.2 粪肠球菌总DNA的提取 | 第20-21页 |
| 3.3.3 16Sr DNA 的 PCR 扩增目片段 | 第21页 |
| 3.3.4 NCBI的Blast比对 | 第21页 |
| 3.4 Cyla的克隆与序列分析 | 第21-24页 |
| 3.4.1 Cyla基因的引物设计 | 第21页 |
| 3.4.2 Cyla基因的扩增 | 第21页 |
| 3.4.3 PCR产物的纯化与回收 | 第21-22页 |
| 3.4.4 重组克隆载体pMD18-T-Cyla的构建 | 第22页 |
| 3.4.5 JM109感受态细胞的制备 | 第22-23页 |
| 3.4.6 转化实验 | 第23页 |
| 3.4.7 重组质粒pMD18-T-Cyla的单、双酶切及PCR鉴定 | 第23-24页 |
| 3.4.8 序列的测定与分析 | 第24页 |
| 3.5 原核表达载体pET-30a(+)-Cyla的构建 | 第24-27页 |
| 3.5.1 原核表达载体pET-30a的提取 | 第24页 |
| 3.5.2 原核表达载体pET-30a(+)的图谱： | 第24-25页 |
| 3.5.3 重组质粒pMD18-T-Cyla和空载体pET-30a(+)的双酶切鉴定 | 第25页 |
| 3.5.4 目的片段Cyla基因与线状的空载体pET-30a(+)连接 | 第25-26页 |
| 3.5.5 重组质粒pET-30a(+)-Cyla的转化实验 | 第26页 |
| 3.5.6 重组质粒pET-30a(+)-Cyla的单、双酶切鉴定以及PCR鉴定 | 第26-27页 |
| 3.6 Cyla基因在工程菌BL21中原核表达以及SDS-PAGE分析 | 第27-28页 |
| 3.6.1 重组质粒pET-30a(+)-Cyla的转化及PCR鉴定 | 第27页 |
| 3.6.2 Cyla基因的蛋白诱导 | 第27页 |
| 3.6.3 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第27-28页 |
| 3.7 Cyla融合蛋白的纯化及SDS-PAGE分析 | 第28页 |
| 3.7.1 Cyla融合蛋白的制备 | 第28页 |
| 3.7.2 Cyla融合蛋白在自然条件下的纯化 | 第28页 |
| 3.7.3 Cyla融合蛋白含量的定量 | 第28页 |
| 3.8 重组Cyla基因蛋白的Westernblot分析 | 第28-30页 |
| 3.8.1 Cyla蛋白样品的制备 | 第28页 |
| 3.8.2 SDS-PAGE | 第28-29页 |
| 3.8.3 转膜与显色 | 第29-30页 |
| 4 实验结果 | 第30-39页 |
| 4.1 粪肠球菌的分离鉴定 | 第30-31页 |
| 4.1.1 菌株的培养与染色 | 第30页 |
| 4.1.2 生化试验结果 | 第30-31页 |
| 4.1.3 药敏试验结果 | 第31页 |
| 4.2 粪肠球菌的16SrDNA的PCR鉴定 | 第31-33页 |
| 4.3 粪肠球菌溶血素基因Cyla的克隆与测序 | 第33-36页 |
| 4.3.1 目的基因的扩增 | 第33页 |
| 4.3.2 重组克隆载体pMD18-T-Cyla的构建和鉴定 | 第33-34页 |
| 4.3.3 克隆基因 Cyla 的 Blast 比对和序列分析 | 第34-36页 |
| 4.4 原核表达载体pET-30a(+)-Cyla的构建与鉴定 | 第36页 |
| 4.5 Cyla基因的原核表达及SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| 4.5.1 pET-30a(+)-Cyla/BL21的PCR鉴定 | 第36-37页 |
| 4.5.2 重组基因Cyla蛋白诱导表达 | 第37页 |
| 4.6 Cyla 蛋白纯化的结果 | 第37-39页 |
| 4.6.3 Cyla 蛋白的 Western blot | 第38-39页 |
| 5 讨论 | 第39-42页 |
| 5.1 菌株的分离 | 第39页 |
| 5.2 致病菌株的生化试验以及药敏试验 | 第39-40页 |
| 5.3 目的基因的选择 | 第40页 |
| 5.4 表达载体的选择 | 第40-41页 |
| 5.5 目的蛋白的纯化 | 第41页 |
| 5.6 实验的不足 | 第41-42页 |
| 6 应用与创新 | 第42-43页 |
| 7 结论 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-49页 |
| 致谢 | 第49-50页 |
| 作者简介 | 第50页 |
