| 中文摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第一章 绪论 | 第16-32页 |
| 1.1 蛋白质工程与酶工程 | 第16-21页 |
| 1.1.1 定点突变 | 第16-17页 |
| 1.1.2 蛋白质体外定向进化 | 第17-19页 |
| 1.1.3 嗜热酶 | 第19-20页 |
| 1.1.4 蛋白质结构域重组 | 第20-21页 |
| 1.2 蛋白质结构预测与理论计算方法简介 | 第21-25页 |
| 1.2.1 同源模建 | 第22-23页 |
| 1.2.2 分子对接 | 第23页 |
| 1.2.3 分子力学 | 第23-24页 |
| 1.2.4 分子动力学 | 第24-25页 |
| 1.3 α-淀粉酶家族与多功能淀粉酶亚家族 | 第25-32页 |
| 1.3.1 α-淀粉酶家族概述 | 第25-26页 |
| 1.3.2 多功能淀粉酶亚家族 | 第26-30页 |
| 1.3.3 多功能淀粉酶 OPMA-N | 第30-32页 |
| 第二章 关键残基Trp358对OPMA-N催化多功能性的影响 | 第32-58页 |
| 2.1 引言 | 第32-33页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第33-42页 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 | 第33-34页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第34页 |
| 2.2.3 DNA 定量检测 | 第34-35页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第35页 |
| 2.2.5 全质粒扩增法引入定点突变 | 第35-36页 |
| 2.2.6 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第36-37页 |
| 2.2.7 质粒（连接产物）的转化 | 第37页 |
| 2.2.8 目的蛋白诱导表达 | 第37页 |
| 2.2.9 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第37-38页 |
| 2.2.10 亲和层析 | 第38-39页 |
| 2.2.11 DNS 法测淀粉酶活力 | 第39-40页 |
| 2.2.12 酶反应动力学数据测定 | 第40页 |
| 2.2.13 温度和 pH 对酶活力以及酶分子稳定性的影响 | 第40页 |
| 2.2.14 催化产物分析 | 第40-41页 |
| 2.2.15 底物特异性 | 第41页 |
| 2.2.16 分子寡聚化程度检测 | 第41页 |
| 2.2.17 理论计算方法和步骤 | 第41-42页 |
| 2.3 实验结果 | 第42-52页 |
| 2.3.1 突变体的选择 | 第42-43页 |
| 2.3.2 OPMA-N 与 OPMA-N*的表达纯化 | 第43页 |
| 2.3.3 酶活力检测结果 | 第43页 |
| 2.3.4 酶反应动力学检测结果 | 第43-45页 |
| 2.3.5 突变体的温度、pH 性质表征 | 第45-46页 |
| 2.3.6 突变体的底物特异性和产物分析 | 第46-48页 |
| 2.3.7 突变体的寡聚化程度检测 | 第48-49页 |
| 2.3.8 OPMA-N 及其突变体的结构模建和分子对接 | 第49-52页 |
| 2.4 讨论 | 第52-56页 |
| 2.5 小结 | 第56-58页 |
| 第三章 328位点空间位阻大小对OPMA-N催化性质的影响 | 第58-74页 |
| 3.1 引言 | 第58-59页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第59-63页 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 | 第59-60页 |
| 3.2.2 质粒的提取 | 第60页 |
| 3.2.3 全质粒扩增法引入定点突变 | 第60-61页 |
| 3.2.4 质粒的转化 | 第61页 |
| 3.2.5 目的蛋白诱导表达 | 第61页 |
| 3.2.6 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第61页 |
| 3.2.7 亲和层析 | 第61页 |
| 3.2.8 DNS 法测淀粉酶活力 | 第61页 |
| 3.2.9 酶反应动力学数据测定 | 第61页 |
| 3.2.10 温度和 pH 对酶活力以及酶分子稳定性的影响 | 第61页 |
| 3.2.11 催化产物分析 | 第61页 |
| 3.2.12 底物特异性 | 第61页 |
| 3.2.13 分子寡聚化程度检测 | 第61-62页 |
| 3.2.14 理论计算方法和步骤 | 第62-63页 |
| 3.3 实验结果 | 第63-70页 |
| 3.3.1 OPMA-N 与突变体的克隆、表达及纯化 | 第63页 |
| 3.3.2 酶活力检测结果 | 第63-66页 |
| 3.3.3 底物特异性和产物比例的变化 | 第66-67页 |
| 3.3.4 酶反应动力学检测 | 第67-68页 |
| 3.3.5 突变体的温度、pH 性质表征 | 第68-69页 |
| 3.3.6 酶分子的寡聚化程度检测 | 第69页 |
| 3.3.7 分子对接结果 | 第69-70页 |
| 3.4 讨论 | 第70-73页 |
| 3.5 小结 | 第73-74页 |
| 第四章 OPMA-N模块重组酶结构和功能的研究 | 第74-90页 |
| 4.1 引言 | 第74-76页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第76-81页 |
| 4.2.1 实验材料和仪器 | 第76-77页 |
| 4.2.2 质粒的提取 | 第77页 |
| 4.2.3 琼脂糖凝胶电泳 | 第77页 |
| 4.2.4 DNA 定量检测 | 第77页 |
| 4.2.5 目的基因的获取 | 第77-78页 |
| 4.2.6 限制性内切酶酶切反应 | 第78页 |
| 4.2.7 DNA 片段的回收 | 第78-79页 |
| 4.2.8 DNA 片段与载体的连接 | 第79页 |
| 4.2.9 连接产物的转化 | 第79页 |
| 4.2.10 阳性克隆筛选与鉴定 | 第79页 |
| 4.2.11 目的蛋白诱导表达 | 第79-80页 |
| 4.2.12 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第80页 |
| 4.2.13 亲和层析 | 第80页 |
| 4.2.14 DNS 法测淀粉酶活力 | 第80页 |
| 4.2.15 酶反应动力学数据测定 | 第80页 |
| 4.2.16 温度和 pH 对酶活力以及酶分子稳定性的影响 | 第80页 |
| 4.2.17 催化产物分析 | 第80页 |
| 4.2.18 底物特异性 | 第80页 |
| 4.2.19 理论计算方法和步骤 | 第80-81页 |
| 4.3 实验结果 | 第81-89页 |
| 4.3.1 OPMA-N 多种结构域重组体克隆表达载体的构建 | 第81页 |
| 4.3.2 OPMA-N 多种结构域重组体的蛋白表达和纯化 | 第81-83页 |
| 4.3.3 结构域重组体与模块组合的酶活力检测 | 第83-85页 |
| 4.3.4 模块重组体的酶反应动力学检测结果 | 第85页 |
| 4.3.5 结构域重组体的底物特异性与产物分析 | 第85-86页 |
| 4.3.6 结构域重组体的温度、pH 性质表征 | 第86-87页 |
| 4.3.7 结构域重组体的分子模建 | 第87-89页 |
| 4.4 小结 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-100页 |
| 作者简介及博士期间发表的论文 | 第100-102页 |
| 致谢 | 第102页 |
