| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7页 |
| List of Abbreviations缩略词 | 第8-13页 |
| 1 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 核仁 | 第13-17页 |
| 1.1.1 核仁的结构 | 第13-14页 |
| 1.1.2 核仁的组装和解体 | 第14-15页 |
| 1.1.3 核仁：核糖体合成的工厂 | 第15-16页 |
| 1.1.4 核仁：不仅是核糖体合成的工厂 | 第16-17页 |
| 1.2 斑马鱼作为模式生物的优势 | 第17-18页 |
| 1.2.1 斑马鱼作为模式生物的历程 | 第17页 |
| 1.2.2 斑马鱼作为模式生物的优势 | 第17-18页 |
| 1.2.3 斑马鱼在研究肝脏发育和再生过程中的优势 | 第18页 |
| 1.3 斑马鱼肝脏发育 | 第18-20页 |
| 1.3.1 斑马鱼肝脏的形态发生 | 第18-19页 |
| 1.3.2 影响斑马鱼肝脏发育的中胚层信号因子 | 第19页 |
| 1.3.3 肝脏发育过程中的其它调控基因 | 第19-20页 |
| 1.4 def基因及其生物学功能 | 第20-22页 |
| 1.4.1 斑马鱼def基因 | 第20-21页 |
| 1.4.2 斑马鱼def~(hi429)突变体的形态分析 | 第21页 |
| 1.4.3 Def在rRNA加工过程中的作用 | 第21页 |
| 1.4.4 Def在p53降解过程中的作用 | 第21-22页 |
| 1.5 本研究的目的、内容和意义 | 第22-23页 |
| 2 实验材料和方法 | 第23-43页 |
| 2.1 斑马鱼实验总述 | 第23-24页 |
| 2.1.1 斑马鱼伦理 | 第23页 |
| 2.1.2 斑马鱼数据库与参考资料 | 第23页 |
| 2.1.3 斑马鱼的饲养与繁殖 | 第23页 |
| 2.1.4 斑马鱼品系 | 第23-24页 |
| 2.1.5 斑马鱼胚胎显微注射(microinjection) | 第24页 |
| 2.2 人类细胞系 | 第24-25页 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 | 第24页 |
| 2.2.2 细胞冻存与复苏 | 第24-25页 |
| 2.2.3 脂质体转染 | 第25页 |
| 2.3 常用溶液及培养基 | 第25-26页 |
| 2.4 DNA相关实验方法 | 第26-30页 |
| 2.4.1 DNA提取 | 第26-27页 |
| 2.4.2 聚合酶链式反应(PCR) | 第27页 |
| 2.4.3 DNA纯化 | 第27页 |
| 2.4.4 DNA片段修饰 | 第27-29页 |
| 2.4.5 大肠杆菌操作 | 第29-30页 |
| 2.4.6 DNA测序 | 第30页 |
| 2.4.7 细胞凋亡检测 | 第30页 |
| 2.4.8 EdU掺入实验 | 第30页 |
| 2.5 RNA相关实验方法 | 第30-33页 |
| 2.5.1 斑马鱼胚胎总RNA提取 | 第30页 |
| 2.5.2 DnaseI消化RNA中残留的DNA | 第30-31页 |
| 2.5.3 RNA逆转录 | 第31页 |
| 2.5.4 mRNA体外转录 | 第31页 |
| 2.5.5 Morpholinos | 第31页 |
| 2.5.6 斑马鱼胚胎整胚原位杂交(WISH) | 第31-33页 |
| 2.6 蛋白相关实验方法 | 第33-36页 |
| 2.6.1 蛋白免疫印迹(Western Blot) | 第33-34页 |
| 2.6.2 蛋白SDS-PAGE分子量计算 | 第34页 |
| 2.6.3 糖苷酶处理 | 第34-35页 |
| 2.6.4 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP)处理 | 第35页 |
| 2.6.5 免疫荧光染色 | 第35-36页 |
| 2.7 转基因鱼的制备 | 第36-37页 |
| 2.8 载体及引物信息列表 | 第37-43页 |
| 3 Def S50,S58,S62,S87和S92为磷酸化修饰位点 | 第43-51页 |
| 3.1 Def蛋白存在磷酸化修饰 | 第43-46页 |
| 3.1.1 内源Def蛋白存在磷酸化修饰 | 第43-44页 |
| 3.1.2 Def蛋白的2-189片段和190-377片段均存在磷酸化修饰 | 第44-45页 |
| 3.1.3 Def蛋白的2-189片段中2-95肽段存在磷酸化修饰 | 第45-46页 |
| 3.2 Def S50,S58,S62,S87和S92为磷酸化修饰位点 | 第46-51页 |
| 3.2.1 Def S50位点突变为A后导致较明显位移 | 第46-47页 |
| 3.2.2 Def S58和S62位点突变为A产生较明显位移 | 第47页 |
| 3.2.3 Def S50,S58,S62,S87和S92为磷酸化修饰位点 | 第47-51页 |
| 4 Def磷酸化修饰调控斑马鱼肝脏发育 | 第51-58页 |
| 4.1 mRNA拯救实验筛选影响斑马鱼肝脏发育的磷酸化修饰位点 | 第51-52页 |
| 4.2 表达磷酸化位点突变Def转基因斑马鱼的构建 | 第52-58页 |
| 4.2.1 转基因斑马鱼的构建 | 第52-53页 |
| 4.2.2 转基因斑马鱼中过表达的mRNA均位于肝脏区域 | 第53-54页 |
| 4.2.3 Def及其磷酸化位点突变蛋白均定位于核仁 | 第54-58页 |
| 5 Def磷酸化修饰调控细胞周期和p53降解 | 第58-68页 |
| 5.1 def~(-/-) Tg(LF：S58,62A)和def~(-/-)Tg(LF:S87,92A)肝脏发育缺陷并非由于细胞凋亡引起 | 第58-59页 |
| 5.2 Def磷酸化修饰调控细胞周期 | 第59-65页 |
| 5.2.1 Def S58和S62的磷酸化修饰调控细胞周期 | 第59-64页 |
| 5.2.2 Def S87和S92的磷酸化修饰调控细胞周期 | 第64-65页 |
| 5.3 Def磷酸化修饰调控核仁中p53的降解 | 第65-68页 |
| 5.3.1 Def在核仁中介导p53降解 | 第65页 |
| 5.3.2 Def磷酸化修饰调控核仁中p53的降解 | 第65-68页 |
| 6 酸性蛋白在SDS-PAGE上的分子量同其理论分子量的差异与酸性氨基酸比例呈线性关系 | 第68-82页 |
| 6.1 Def在SDS-PAGE上的分子量比氨基酸序列预测的理论分子量大～13 kDa | 第68-69页 |
| 6.2 Def蛋白的迁移特性并非由于氨基酸序列错误引起 | 第69页 |
| 6.3 DefN端导致其在SDS-PAGE上的分子量比理论分子量大 ～13 kDa | 第69-72页 |
| 6.4 Def蛋白的迁移特性并不主要由蛋白翻译后修饰引起 | 第72-75页 |
| 6.4.1 DefN端没有糖基化修饰 | 第72-73页 |
| 6.4.2 DefN端没有发生(类)泛素化修饰 | 第73-74页 |
| 6.4.3 Def片段D16和D17分担了D15的迁移特性 | 第74-75页 |
| 6.5 DefN端酸性氨基酸富集的特性引起迁移速率变慢 | 第75-78页 |
| 6.5.1 DefN端拥有高比例的酸性氨基酸E和D | 第75页 |
| 6.5.2 △MW与酸性氨基酸的含量呈线性正相关 | 第75-78页 |
| 6.6 方程成功地预测酸性蛋白Sas10,Mpp10和Bms11在SDS-PAGE上的大小 | 第78-80页 |
| 6.7 方程成功地预测来自引用文献的酸性蛋白在SDS-PAGE上的大小 | 第80-82页 |
| 7 讨论和结论 | 第82-90页 |
| 7.1 讨论一：Def磷酸化修饰 | 第82-84页 |
| 7.2 讨论二：Fibrillarin是Def-Capn3核仁降解途径的另一个底物? | 第84-87页 |
| 7.3 讨论三：酸性氨基酸影响蛋白迁移速率方程的构建 | 第87-88页 |
| 7.4 结论 | 第88-90页 |
| 8 参考文献 | 第90-98页 |
| 作者简介 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99-101页 |
