| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-28页 |
| 1.1 引言 | 第12-17页 |
| 1.1.1 L(+)-酒石酸生产方式 | 第12-13页 |
| 1.1.2 酶催化法的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.1.3 顺式还氧琥珀酸水解酶的可溶性表达 | 第15页 |
| 1.1.4 顺式还氧琥珀酸水解酶的适宜温度 | 第15-16页 |
| 1.1.5 提高CESH的热稳定性 | 第16-17页 |
| 1.2 定向进化 | 第17-21页 |
| 1.2.1 定向进化技术的原理 | 第17-18页 |
| 1.2.2 定向进化的思路 | 第18页 |
| 1.2.3 建立突变文库 | 第18-21页 |
| 1.2.4 建立高通量筛选方法 | 第21页 |
| 1.3 半理性设计 | 第21-26页 |
| 1.3.1 基于结构信息的靶向随机突变 | 第22-25页 |
| 1.3.2 基于蛋白质序列同源性的改造 | 第25-26页 |
| 1.4 课题研究的研究思路 | 第26-28页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第28-42页 |
| 2.1 菌种和质粒 | 第28-29页 |
| 2.2 仪器和工具 | 第29-31页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第29页 |
| 2.2.2 工具酶及主要试剂 | 第29-31页 |
| 2.3 培养基和培养条件 | 第31页 |
| 2.3.1 定点突变和酶活性测定所用 | 第31页 |
| 2.3.2 定向进化所用 | 第31页 |
| 2.4 实验分析方法 | 第31-42页 |
| 2.4.1 pH值的测定 | 第31页 |
| 2.4.2 菌体浓度测定 | 第31页 |
| 2.4.3 琼脂糖凝胶电泳 | 第31-32页 |
| 2.4.4 质粒的提取 | 第32-33页 |
| 2.4.5 大肠杆菌超声破碎方法 | 第33页 |
| 2.4.6 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳实验 | 第33-35页 |
| 2.4.7 蛋白的纯化 | 第35-36页 |
| 2.4.8 蛋白浓度的测定 | 第36页 |
| 2.4.9 CESH酶学性质的测定 | 第36-37页 |
| 2.4.10 感受态细胞的制备和转化 | 第37-42页 |
| 第三章 顺式环氧琥珀酸水解酶CESH表达体系优化 | 第42-54页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 实验方法 | 第42-44页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第42页 |
| 3.2.2 基本培养条件 | 第42-43页 |
| 3.2.3 工具酶及主要试剂 | 第43页 |
| 3.2.4 质粒DNA的提取 | 第43页 |
| 3.2.5 DNA的检测以及切胶回收 | 第43页 |
| 3.2.6 重组质粒的构建 | 第43-44页 |
| 3.2.7 构建重组菌 | 第44页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第44-52页 |
| 3.3.1 CESH结构基因的密码子优化 | 第44-45页 |
| 3.3.2 构建重组质粒 | 第45-46页 |
| 3.3.3 重组质粒pET28a(+)-CESH的构建 | 第46-47页 |
| 3.3.4 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-CESH的构建 | 第47-49页 |
| 3.3.5 摇瓶中不同重组菌诱导条件优化及比较 | 第49-51页 |
| 3.3.6 96孔板中工程菌培养、诱导条件的优化 | 第51-52页 |
| 3.4 小结 | 第52-54页 |
| 第四章 顺式环氧琥珀酸水解酶CESH的定向进化 | 第54-66页 |
| 4.1 引言 | 第54页 |
| 4.2 菌株、质粒和酶 | 第54-55页 |
| 4.3 建立突变率稳定的突变文库 | 第55-60页 |
| 4.3.1 不同PCR循环下的突变率控制 | 第55-56页 |
| 4.3.2 使用无自检能力的Taq聚合酶 | 第56-59页 |
| 4.3.3 使用高保真Pfu聚合酶 | 第59-60页 |
| 4.4 感受态细胞的选择 | 第60-62页 |
| 4.5 高通量筛选 | 第62-64页 |
| 4.6 小结 | 第64-66页 |
| 第五章 顺式环氧琥珀酸水解酶CESH的半理性设计 | 第66-78页 |
| 5.1 引言 | 第66页 |
| 5.2 基于MSAs的设计与改造 | 第66-68页 |
| 5.3 基于同源模建的设计与改造 | 第68-71页 |
| 5.3.1 CESH同源模建 | 第68-70页 |
| 5.3.2 计算机模拟突变 | 第70-71页 |
| 5.4 定点饱和突变 | 第71-74页 |
| 5.5 突变子5x-1的性质分析 | 第74-77页 |
| 5.5.1 突变子5X-1环境抗逆性 | 第74-75页 |
| 5.5.2 固定化下突变子5X-1和野生型CESH的比较 | 第75-77页 |
| 5.6 小结 | 第77-78页 |
| 第六章 总结和展望 | 第78-80页 |
| 6.1 总结 | 第78-79页 |
| 6.2 展望 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-88页 |
| 攻读硕士学位论文期间研究成果 | 第88页 |
| 已发表论文 | 第88页 |
| 申报专利 | 第88页 |
