| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第7-12页 |
| 第一章 文献综述及选题的目的和意义 | 第12-26页 |
| 1. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的研究概况 | 第12-21页 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的病原学及培养特性 | 第12页 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的培养特性 | 第12页 |
| 1.3 APP的分类概况及毒力因子 | 第12-15页 |
| 1.3.1 外毒素(RTX-TOXINS,APx) | 第13-14页 |
| 1.3.2 脂多糖((LIPOPOLYSACCHARIDE,LPS) | 第14页 |
| 1.3.3 荚膜多糖(CAPCULAR POLYSACCHARIDE,CPS) | 第14页 |
| 1.3.4 外膜蛋白(OUTERMEMBRANEPROTEINS,OMP) | 第14-15页 |
| 1.3.5 APP的其它毒力因子 | 第15页 |
| 1.4 APP的疫苗研究进展 | 第15-18页 |
| 1.4.1 灭活疫苗 | 第16页 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 | 第16-17页 |
| 1.4.3 GHOSTS疫苗 | 第17页 |
| 1.4.4 弱毒活疫苗 | 第17-18页 |
| 1.5 APP的检测方法检测进展 | 第18-21页 |
| 1.5.1 微生物学诊断方法 | 第18页 |
| 1.5.2 血清学诊断方法 | 第18-20页 |
| 1.5.3 聚合酶链式反应(POLYMERASE CHAIN REACTION,PCR)诊断方法 | 第20-21页 |
| 2. LAMP检测方法的研究进展 | 第21-25页 |
| 2.1 LAMP检测方法的原理 | 第21-23页 |
| 2.2 LAMP检测方法在检测病毒上的应用 | 第23-24页 |
| 2.3 LAMP检测方法在检测细菌上的应用 | 第24-25页 |
| 3. 本研究的目的与意义 | 第25-26页 |
| 第二章 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP检测方法的建立 | 第26-39页 |
| 1. 实验材料 | 第26-28页 |
| 1.1 菌株与毒株 | 第26页 |
| 1.2 试剂及其它试剂的配制 | 第26-28页 |
| 1.2.1 主要试剂及其来源 | 第27-28页 |
| 1.2.2 主要仪器及其来源 | 第28页 |
| 2. 实验方法 | 第28-33页 |
| 2.1 菌种的培养 | 第28-29页 |
| 2.2 核酸的提取 | 第29页 |
| 2.3 LAMP引物的设计 | 第29-31页 |
| 2.4 LAMP反应体系的建立 | 第31-32页 |
| 2.4.1 LAMP检测方法的反应体系反应条件 | 第31页 |
| 2.4.2 反应温度的优化 | 第31-32页 |
| 2.4.3 反应时间的优化 | 第32页 |
| 2.4.4 内部、外部引物比的优化 | 第32页 |
| 2.4.5 镁离子浓度的优化 | 第32页 |
| 2.4.6 BETAINE浓度的优化 | 第32页 |
| 2.4.8 LAMP反应对各血清型的APP的检测情况分析 | 第32页 |
| 2.5 LAMP检测方法特异性检验 | 第32-33页 |
| 2.6 LAMP检测方法灵敏性探索 | 第33页 |
| 2.7 临床样品的检测 | 第33页 |
| 3. 结果与分析 | 第33-37页 |
| 3.1 LAMP反应的建立 | 第33-35页 |
| 3.1.1 多次重复验证后确定的LAMP最佳反应体系 | 第33-34页 |
| 3.1.2 确定后的LAMP对APP各血清的检测结果 | 第34-35页 |
| 3.2 LAMP反应的特异性结果 | 第35页 |
| 3.3 LAMP反应的灵敏性结果 | 第35-36页 |
| 3.4 LAMP检测方法临床样品的检测结果分析 | 第36-37页 |
| 4. 讨论 | 第37-39页 |
| 第三章 APX Ⅳ毒素部分功能研究 | 第39-64页 |
| 1. 实验材料 | 第39-41页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第39页 |
| 1.2 试剂及仪器 | 第39-41页 |
| 1.2.1 主要试剂及其来源 | 第39-41页 |
| 1.2.2 实验仪器及其来源 | 第41页 |
| 1.3 实验动物 | 第41页 |
| 2. 实验方法 | 第41-53页 |
| 2.1 引物设计与合成 | 第41-42页 |
| 2.2 APP基因组的提取 | 第42页 |
| 2.3 克隆载体的构建 | 第42-46页 |
| 2.3.1 目的片段的PCR扩增 | 第42-43页 |
| 2.3.2 PCR产物的电泳检测及胶回收 | 第43页 |
| 2.3.3 目的片段与T载体的连接 | 第43-44页 |
| 2.3.4 目的片段的转化 | 第44-45页 |
| 2.3.5 重组质粒双酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 2.4 表达载体的构建立及转化 | 第46-47页 |
| 2.4.1 目的片段与表达载体的连接 | 第46-47页 |
| 2.4.2 感受态细胞的制备 | 第47页 |
| 2.4.3 表达载体的转化 | 第47页 |
| 2.4.2 表达载体的双酶切鉴定 | 第47页 |
| 2.5 蛋白表达、纯化与活性检测 | 第47-50页 |
| 2.5.1 重组表达菌株的诱导表达及表达条件的优化 | 第47页 |
| 2.5.2 诱导产物的SDS-PAGE检测 | 第47-48页 |
| 2.5.3 表达产物的可溶性检测 | 第48页 |
| 2.5.4 表达产物的纯化及SDS-PAGE检测蛋白纯化效果 | 第48-49页 |
| 2.5.5 表达产物的复性及WESTERN BLOT检验蛋白活性 | 第49-50页 |
| 2.6 疫苗的制备 | 第50页 |
| 2.6.1 APXⅠ、APXⅡ毒素的提取 | 第50页 |
| 2.6.2 蛋白浓度的测定 | 第50页 |
| 2.7 动物实验 | 第50-52页 |
| 2.7.1 疫苗的制备及免疫 | 第50-51页 |
| 2.7.2 APP半数致死量(LD_(50))的测定 | 第51-52页 |
| 2.7.3 攻毒 | 第52页 |
| 2.8 病理学检查 | 第52-53页 |
| 2.8.1 临床病理变化观察 | 第52页 |
| 2.8.2 病理组织学观察 | 第52-53页 |
| 3. 结果与分析 | 第53-62页 |
| 3.1 原核表达载体的构建 | 第53-54页 |
| 3.1.1 目的基因的克隆及与T载体的连接 | 第53-54页 |
| 3.1.2 目的基因与表达载体的连接与鉴定 | 第54页 |
| 3.2 重组蛋白的诱导表达、条件优化、纯化与活性检测 | 第54-58页 |
| 3.2.1 蛋白的诱导表达与可溶性检测 | 第54-55页 |
| 3.2.2 重组蛋白表达的条件优化 | 第55-56页 |
| 3.2.3 包涵体的纯化 | 第56-57页 |
| 3.2.4 重组蛋白复性后的抗原性分析 | 第57-58页 |
| 3.4 APXⅠ、APXⅡ毒素的提取 | 第58页 |
| 3.5 动物实验结果 | 第58-62页 |
| 3.5.1 APP 5型LD_(50)剂量 | 第58-59页 |
| 3.5.2 攻毒后疫苗免疫保护力 | 第59页 |
| 3.5.3 攻毒后各组小鼠肺脏组织学变化 | 第59-62页 |
| 4. 讨论 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 作者简介及攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第70页 |
