| 中文摘要 | 第12-15页 |
| 英文摘要 | 第15-17页 |
| 1 引言 | 第18-37页 |
| 1.1 猪源肠致病性E.coli的主要毒力因子 | 第18-26页 |
| 1.1.1 肠毒素 | 第18-22页 |
| 1.1.2 黏附因子 | 第22-26页 |
| 1.1.3 其他毒力因子 | 第26页 |
| 1.2 E.coli同源重组技术 | 第26-29页 |
| 1.2.1 自杀载体法 | 第27-28页 |
| 1.2.2 “线性片段”的方法 | 第28-29页 |
| 1.3 肠致病性E.coli疫苗 | 第29-31页 |
| 1.3.1 灭活疫苗 | 第29页 |
| 1.3.2 粘附素类疫苗 | 第29-30页 |
| 1.3.3 基因工程疫苗 | 第30-31页 |
| 1.4 细菌活载体疫苗 | 第31-36页 |
| 1.4.1 减毒沙门氏菌疫苗 | 第31-32页 |
| 1.4.2 重组BCG载体疫苗 | 第32-33页 |
| 1.4.3 重组乳酸菌载体疫苗 | 第33-34页 |
| 1.4.4 志贺菌载体疫苗 | 第34-35页 |
| 1.4.5 李斯特菌载体疫苗 | 第35页 |
| 1.4.6 大肠杆菌载体疫苗 | 第35-36页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第36-37页 |
| 2 材料与方法 | 第37-71页 |
| 2.1 实验材料 | 第37-47页 |
| 2.1.1 病料 | 第37页 |
| 2.1.2 菌株 | 第37-39页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第39-44页 |
| 2.1.4 载体 | 第44-45页 |
| 2.1.5 实验动物及细胞系 | 第45页 |
| 2.1.6 主要试剂 | 第45-46页 |
| 2.1.7 ELISA包被抗原 | 第46页 |
| 2.1.8 主要仪器 | 第46-47页 |
| 2.2 实验方法 | 第47-71页 |
| 2.2.1 仔猪腹泻粪便中E.coli的流行病学调查 | 第47-49页 |
| 2.2.2 E.coli O142的部分生物学特性鉴定 | 第49-50页 |
| 2.2.3 E.coli O142减毒菌株的构建 | 第50-53页 |
| 2.2.4 基于λ噬菌体Kil基因的E.coli双向筛选平台的构建 | 第53-56页 |
| 2.2.5 基于红色荧光蛋白mKate2基因的E.coli双向筛选平台的构建 | 第56-58页 |
| 2.2.6 利用双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)构建重组菌株ER-A | 第58-61页 |
| 2.2.7 利用双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)构建重组菌株ER-B | 第61-63页 |
| 2.2.8 重组E.coli ER-A及ER-B作为口服疫苗的可行性分析 | 第63-66页 |
| 2.2.9 重组E.coli ER-A及ER-B对小鼠的免疫学指标测定 | 第66-68页 |
| 2.2.10 重组E.coli ER-A及ER-B对猪的免疫学指标测定 | 第68-71页 |
| 3 结果 | 第71-148页 |
| 3.1 流行病学调查结果 | 第71-77页 |
| 3.1.1 E.coli的分离与鉴定 | 第71页 |
| 3.1.2 E.coli毒力因子的PCR检测 | 第71-73页 |
| 3.1.3 肠毒素相关基因的分离情况 | 第73页 |
| 3.1.4 菌毛及非菌毛粘附因子基因的分离情况 | 第73-74页 |
| 3.1.5 毒力因子的分布及特征 | 第74页 |
| 3.1.6 毒力因子在不同地区的分布情况 | 第74-77页 |
| 3.2 E.coli O142的鉴定 | 第77-79页 |
| 3.2.1 E.coli O142菌株的鉴定 | 第77页 |
| 3.2.2 E.coli O142菌毛的电镜观察 | 第77-78页 |
| 3.2.3 E.coli O142对ZYM-DIEC02细胞的毒性作用 | 第78-79页 |
| 3.2.4 E.coli O142对乳鼠的毒性 | 第79页 |
| 3.3 减毒E.coli O142：ΔSTa的构建及鉴定 | 第79-82页 |
| 3.3.1 抗性基因Kan的扩增 | 第79-80页 |
| 3.3.2 重组载体pSTa中Kan基因的检测 | 第80页 |
| 3.3.3 减毒E coli O142：ΔSTa的鉴定 | 第80-81页 |
| 3.3.4 减毒E.coli O142：ΔSTa对ZYM-DIEC02细胞的毒性作用 | 第81-82页 |
| 3.3.5 减毒E.coli O142：ΔSTa对乳鼠的毒性 | 第82页 |
| 3.4 基于Kil基因的E.coli双向筛选平台的构建及鉴定 | 第82-87页 |
| 3.4.1 噬菌体Kil基因的扩增 | 第82-83页 |
| 3.4.2 CIts857-PRPL启动子序列的扩增 | 第83-84页 |
| 3.4.3 rrnB转录终止子基因的扩增 | 第84页 |
| 3.4.4 CIts857-PRPL-Kil-rrnB操纵子的鉴定 | 第84-85页 |
| 3.4.5 假基因yaiT同源臂的扩增 | 第85页 |
| 3.4.6 pKil-donor载体的鉴定 | 第85-86页 |
| 3.4.7 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)的PCR鉴定 | 第86页 |
| 3.4.8 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-Kil)的验证 | 第86-87页 |
| 3.5 基于mKate2基因的E.coli双向筛选平台的构建及验证 | 第87-90页 |
| 3.5.1 红色荧光蛋白mKate2基因的扩增 | 第87-88页 |
| 3.5.2 CIts857-PRPL-mKate2-rrnB操纵子的鉴定 | 第88页 |
| 3.5.3 pmKate2-Donor载体的鉴定 | 第88-89页 |
| 3.5.4 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)的PCR鉴定 | 第89页 |
| 3.5.5 双向筛选平台O142(yaiT::PRPL-mKate2)的验证 | 第89-90页 |
| 3.6 递呈LT192-STa13嵌合蛋白的重组菌株ER-A的构建及鉴定 | 第90-93页 |
| 3.6.1 LT192-STa13嵌合类毒素基因的构建及鉴定 | 第90-91页 |
| 3.6.2 pL-S-Donor载体的鉴定 | 第91-92页 |
| 3.6.3 重组菌株ER-A的PCR鉴定 | 第92页 |
| 3.6.4 重组E.coli ER-A中LT192-STa13蛋白的Western blot分析 | 第92-93页 |
| 3.7 递呈LT192-STb嵌合蛋白的重组菌株ER-B的构建及鉴定 | 第93-96页 |
| 3.7.1 LT192-STb嵌合类毒素基因的构建及鉴定 | 第93-94页 |
| 3.7.2 重组打靶载体pL-S-Donor载体的鉴定 | 第94-95页 |
| 3.7.3 重组菌株ER-B的PCR鉴定 | 第95页 |
| 3.7.4 重组E.coli ER-B中LT192-STb蛋白的Western blot分析 | 第95-96页 |
| 3.8 E.coli ER-A及ER-B作为口服疫苗递呈抗原载体的可行性评价 | 第96-104页 |
| 3.8.1 ER-A及ER-B对ZYM-DIEC02细胞的毒性 | 第96-97页 |
| 3.8.2 ER-A及ER-B对乳鼠的毒性 | 第97-98页 |
| 3.8.3 ER-A及ER-B对胃液环境的耐受性 | 第98页 |
| 3.8.4 ER-A及ER-B对肠液环境耐受性 | 第98-99页 |
| 3.8.5 ER-A及ER-B对胆汁的耐受性 | 第99-100页 |
| 3.8.6 ER-A及ER-B的口服安全性 | 第100-101页 |
| 3.8.7 ER-A及ER-B的生长曲线 | 第101页 |
| 3.8.8 ER-A及ER-B的电镜观察 | 第101-102页 |
| 3.8.9 ER-A及ER-B的遗传稳定性 | 第102-103页 |
| 3.8.10 ER-A及ER-B的定植能力 | 第103-104页 |
| 3.9 重组E.coli ER-A及ER-B对小鼠的口服免疫效果测定 | 第104-124页 |
| 3.9.1 免疫小鼠特异性抗体IgG测定 | 第104-108页 |
| 3.9.2 免疫小鼠特异性抗体sIgA测定 | 第108-112页 |
| 3.9.3 淋巴细胞增殖结果 | 第112-113页 |
| 3.9.4 Th1和Th2细胞亚类的检测 | 第113-114页 |
| 3.9.5 体外中和试验 | 第114-119页 |
| 3.9.6 乳鼠体内中和试验 | 第119-123页 |
| 3.9.7 乳鼠攻毒保护试验 | 第123-124页 |
| 3.10 重组菌株对猪的口服免疫效果测定 | 第124-148页 |
| 3.10.1 ER-A及ER-B在猪肠道内的定植能力 | 第124-126页 |
| 3.10.2 免疫猪特异性抗体IgG测定 | 第126-130页 |
| 3.10.3 免疫猪特异性抗体sIgA测定 | 第130-134页 |
| 3.10.4 猪淋巴细胞增殖结果 | 第134-136页 |
| 3.10.5 Th1和Th2细胞亚类的检测 | 第136页 |
| 3.10.6 体外中和试验 | 第136-140页 |
| 3.10.7 乳鼠体内中和试验 | 第140-144页 |
| 3.10.8 攻毒保护试验 | 第144-148页 |
| 4 讨论 | 第148-165页 |
| 4.1 猪源肠致病性E.coli流行情况 | 第148-150页 |
| 4.1.1 黏附因子分离率及分布特征 | 第148-149页 |
| 4.1.2 肠毒素和黏附因子之间的关系 | 第149页 |
| 4.1.3 肠毒素基因的流行特点 | 第149-150页 |
| 4.1.4 耶尔森毒力岛的流行特点 | 第150页 |
| 4.2 E.coli双向筛选平台的构建 | 第150-154页 |
| 4.2.1 同源重组方法的选择 | 第150-151页 |
| 4.2.2 Kil及mKate2操纵子的优势 | 第151-153页 |
| 4.2.3 选择假基因yaiT作为外源序列插入位点的理由 | 第153-154页 |
| 4.3 ER-A及ER-B作为口服疫苗候选菌株的可行性分析 | 第154-159页 |
| 4.3.1 口服疫苗对肠致病性E.coli进行免疫防控的优势 | 第154-157页 |
| 4.3.2 肠致病性E.coli疫苗的设计 | 第157页 |
| 4.3.3 用LT192-STa13和LT192-STb嵌合类毒素作为靶抗原的优势 | 第157-158页 |
| 4.3.4 ER-A及ER-B的主要生物学特性 | 第158-159页 |
| 4.4 ER-A和ER-B的免疫效果 | 第159-160页 |
| 4.5 本研究的局限和不足之处 | 第160-163页 |
| 4.6 重组细菌活载体疫苗的发展方向及可能存在的问题 | 第163-165页 |
| 5 结论 | 第165-166页 |
| 致谢 | 第166-167页 |
| 参考文献 | 第167-181页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第181页 |
