| 中文摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第13-15页 |
| 前言 | 第15-23页 |
| 1 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的耐药现状 | 第15-16页 |
| 2 含bla_(NDM-1)耐药酶基因肠杆菌科细菌质粒研究现状 | 第16-17页 |
| 3 含bla_(CTX-M_类耐药酶基因肠杆菌科细菌质粒研究现状 | 第17-18页 |
| 4 CRE菌株检测手段 | 第18-19页 |
| 5 CRE菌株的治疗及新型抗菌肽研究 | 第19-21页 |
| 6 Colicin Ia+KWKAQKRFLK融合蛋白研究 | 第21-23页 |
| 第一部分 耐碳青霉巧类肠杆菌科细苗的分子特征及耐药机制 | 第23-83页 |
| 第一章 北京地区肠杆菌科细菌碳青霉烯类耐药分析 | 第23-32页 |
| 1 实验材料 | 第23-24页 |
| 1.1 临床菌株 | 第23页 |
| 1.2 培养基 | 第23页 |
| 1.3 试剂与药品 | 第23页 |
| 1.4 仪器及耗材 | 第23-24页 |
| 2 试验方法 | 第24-28页 |
| 2.1 Vitek2全自动微生物分析仪鉴定细菌 | 第24-25页 |
| 2.2 MIC测定筛选CRE(平皿法) | 第25-26页 |
| 2.3 基因确证 | 第26-28页 |
| 3 实验结果 | 第28-30页 |
| 4 讨论 | 第30-31页 |
| 5 小结 | 第31-32页 |
| 第二章 含blaNDM-1、blaCTX-M-15基因的肠杆菌科细菌特征分析 | 第32-83页 |
| 1 试验材料 | 第32-34页 |
| 1.1 标准菌株与临床菌株 | 第32页 |
| 1.2 试剂与药品 | 第32-33页 |
| 1.3 仪器与耗材 | 第33-34页 |
| 2 试验方法 | 第34-55页 |
| 2.1 表型验证 | 第34-35页 |
| 2.2 MIC测定(肉汤微量稀释法) | 第35-36页 |
| 2.3 碱裂解法提取临床菌株大质粒 | 第36-37页 |
| 2.4 耐药酶基因检测 | 第37-42页 |
| 2.4.1 Ambler分类ESBL A类耐药基因 | 第37页 |
| 2.4.2 Ambler分类ESBL B类耐药基因 | 第37页 |
| 2.4.3 Ambler分类ESBL D类耐药基因 | 第37页 |
| 2.4.4 氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因 | 第37页 |
| 2.4.5 介导氨基糖苷类高水平耐药的16S rRNA甲基化酶基因 | 第37页 |
| 2.4.6 喹诺酮类耐药(PMQR)基因 | 第37页 |
| 2.4.7 AmpC β-内酰胺酶基因 | 第37-42页 |
| 2.5 细菌多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST) | 第42-44页 |
| 2.6 滤膜法接合转移试验(Conjugation assay) | 第44-45页 |
| 2.7 基于PCR的质粒复制子分型(PCR-based Replicon Typing,PBRT) | 第45-48页 |
| 2.8 质粒整合子类型分析 | 第48-49页 |
| 2.9 脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE) | 第49-54页 |
| 2.9.1 Xba I-PFGE | 第49-53页 |
| 2.9.2 S1-PFGE | 第53-54页 |
| 2.9.3 Quantity One绘制菌株进化树及质粒分子量确定 | 第54页 |
| 2.10 磁珠法回收接合转移子质粒 | 第54-55页 |
| 2.11 对接合转移子质粒进行基因确证及复制子分型分析 | 第55页 |
| 2.12 测序确证及NCBI比对确证 | 第55页 |
| 3 结果 | 第55-78页 |
| 4 讨论 | 第78-82页 |
| 4.1 接合转移试验分析 | 第78页 |
| 4.2 接合转移子分析 | 第78-79页 |
| 4.3 接合转移子MIC值分析 | 第79页 |
| 4.4 IncN流行性质粒分型分析 | 第79-80页 |
| 4.5 菌株ST分型及流行性质粒ST分型分析 | 第80-81页 |
| 4.6 基因沉默现象及耐药率监测分析 | 第81-82页 |
| 5 小结 | 第82-83页 |
| 第二部分 碳青霉烯酶库的构建 | 第83-121页 |
| 第一章 重组碳青霉烯酶表达纯化 | 第83-121页 |
| 1 实验材料 | 第83-86页 |
| 1.1 菌株 | 第83页 |
| 1.2 培养基 | 第83页 |
| 1.3 试剂 | 第83页 |
| 1.4 缓冲液 | 第83-85页 |
| 1.5 仪器与耗材 | 第85-86页 |
| 2 试验方法 | 第86-105页 |
| 2.1 CTX-M-15碳青霉烯酶表达纯化 | 第86-96页 |
| 2.1.1 pMD(?)18-T-N/C-His-CTX-M-15克隆载体构建 | 第86-90页 |
| 2.1.2 pET-30a(+)-N/C-His-CTX-M-15表达载体构建 | 第90-92页 |
| 2.1.3 CTX-M-15纯化表达 | 第92-95页 |
| 2.1.4 CTX-M-15蛋白浓度定量 | 第95页 |
| 2.1.5 CTX-M-15重组酶水解活性测定和酶抑制剂水解保护特性研究 | 第95-96页 |
| 2.1.6 CTX-M-15酶促动力学参数测定 | 第96页 |
| 2.2 VIM2碳青霉烯酶表达纯化 | 第96-99页 |
| 2.2.1 pMD(?)18-T-N-His-VIM2克隆载体构建 | 第96-97页 |
| 2.2.2 pET-30a(+)-N-His-VIM2表达载体构建 | 第97页 |
| 2.2.3 VIM2表达纯化 | 第97-98页 |
| 2.2.4 VIM2蛋白浓度测定 | 第98页 |
| 2.2.5 VIM2重组酶水解活性测定和酶抑制剂水解保护特性研究 | 第98页 |
| 2.2.6 VIM2酶促动力学参数测定 | 第98-99页 |
| 2.3 OXA-23碳青霉烯酶表达纯化 | 第99-100页 |
| 2.3.1 pMD~·18-T-C-His-OXA23克隆载体构建 | 第99-100页 |
| 2.3.2 pET-30a(+)-C-His-OXA23表达载体构建 | 第100页 |
| 2.3.3 OXA23蛋白表达纯化 | 第100页 |
| 2.3.4 OXA23蛋白浓度测定 | 第100页 |
| 2.4 SHV-18碳青霉烯酶表达纯化 | 第100-102页 |
| 2.4.1 pMD(?)18-T-N-His-SHV-18克隆载体构建 | 第101页 |
| 2.4.2 pET-30a(+)-N-His-SHV-18表达载体构建 | 第101-102页 |
| 2.4.3 SHV-18蛋白表达纯化 | 第102页 |
| 2.4.4 SHV-18蛋白浓度测定 | 第102页 |
| 2.5 KPC1/2,KPC3碳青霉烯酶表达纯化 | 第102-104页 |
| 2.5.1 pMD(?)18-T-KPC1/2,pMD(?)18-T-KPC3克隆载体构建 | 第102-103页 |
| 2.5.2 pET-30a(+)-KPC1/2,pET-30a(+)-KPC3表达载体构建 | 第103-104页 |
| 2.5.3 KPC蛋白纯化表达 | 第104页 |
| 2.5.4 溶解KPC1/2包涵体蛋白 | 第104页 |
| 2.6 重组酶Western Blot鉴定 | 第104-105页 |
| 3 结果 | 第105-117页 |
| 4 讨论 | 第117-120页 |
| 4.1 VIM2表达分析 | 第117-118页 |
| 4.2 CTX-M-15水解活性分析 | 第118页 |
| 4.3 VIM2,CTX-M-15酶促动力学参数分析 | 第118-120页 |
| 5 小结 | 第120-121页 |
| 第三部分 Colicin Ia-KWKAQKRFLK杂合抗菌肽的构建及活性分析 | 第121-151页 |
| 第一章 Colicin Ia杀菌蛋白表达载体的构建及蛋白纯化和活性鉴定 | 第121-138页 |
| 1 试验材料 | 第121-122页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第121页 |
| 1.2 培养基 | 第121页 |
| 1.3 试剂与药品 | 第121-122页 |
| 1.4 仪器与耗材 | 第122页 |
| 2 Colicin Ia大肠菌素载体构建及表达鉴定 | 第122-134页 |
| 2.1 产大肠菌素大肠埃希菌(Colicinogenic E. coli)筛选 | 第122-124页 |
| 2.2 构建pMD(?)18-T-Colicin la克隆载体 | 第124-126页 |
| 2.3 构建pET-30a(+)-Colicin la表达载体 | 第126-127页 |
| 2.4 构建构建pMD~·18-T-Colicin la-Imm-PR克隆载体 | 第127-129页 |
| 2.5 构建pET-30a(+)-Colicin Ia+lmm表达载体 | 第129-130页 |
| 2.6 Colicin Ia重组蛋白表达条件优化 | 第130-131页 |
| 2.7 Colicin Ia重组蛋白表达位点确定 | 第131-132页 |
| 2.8 离子交换纯化Colicin Ia蛋白 | 第132-133页 |
| 2.9 PD-10柱脱盐处理及蛋白保存 | 第133页 |
| 2.10 Colicin Ia蛋白浓度测定(凯基Lowry法) | 第133-134页 |
| 3 试验结果 | 第134-138页 |
| 第二章 Colicin Ia-KWKAQKRFLK杂合抗菌肽表达纯化及活性鉴定 | 第138-151页 |
| 1 实验材料 | 第138页 |
| 1.1 耗材 | 第138页 |
| 1.2 试剂 | 第138页 |
| 2 试验方法 | 第138-144页 |
| 2.1 KWKAQKRFLK十肽片段合成 | 第139页 |
| 2.2 KWKAQKRFLK基因片段合成 | 第139-140页 |
| 2.3 pET30a(+)-Colicin Ia-KWKAQKRFLK-Imm-PR表达载体构建 | 第140-141页 |
| 2.4 pET30a(+)-Colicin Ia-KWKAQKRFLK-Imm-PR纯化表达 | 第141-142页 |
| 2.5 非干扰型蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度 | 第142页 |
| 2.6 融合蛋白杀菌活性测定 | 第142-143页 |
| 2.7 KWKAQKRFLK优化设计 | 第143-144页 |
| 3 结果 | 第144-149页 |
| 3.1 KWKAQKRFLK十肽合成 | 第144页 |
| 3.2 pMD(?)18-T-101bp克隆载体构建 | 第144-145页 |
| 3.3 pET30a-Colicin la-KWKAQKRFLK-Imm-PR表达载体构建 | 第145页 |
| 3.4 Colicin Ia-KWKAQKRFLK融合蛋白表达纯化 | 第145-147页 |
| 3.5 Colicin Ia,KWKAQKRFLK和Colicin Ia-KWKAQKRFLK融合蛋白活性测定 | 第147页 |
| 3.6 KWKAQKRFLK优化设计 | 第147-149页 |
| 4 讨论 | 第149-150页 |
| 4.1 KWKAQKRFLK优化设计分析 | 第149页 |
| 4.3 融合蛋白优化设计 | 第149-150页 |
| 5 小结 | 第150-151页 |
| 结论 | 第151-152页 |
| 参考文献 | 第152-163页 |
| 附录 | 第163-166页 |
| 1 KWKAQKRFLK合成结果图 | 第163-164页 |
| 2 大肠杆菌偏爱密码子 | 第164-165页 |
| 3 酶促动力学参数测定在线监测反应图 | 第165-166页 |
| 文献综述 | 第166-174页 |
| 参考文献 | 第170-174页 |
| 个人简历、在校期间发表的学术论文 | 第174-183页 |
| 致谢 | 第183-184页 |
| 附录 | 第184-189页 |
