| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 符号说明 | 第12-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-24页 |
| 1.1 类风湿性关节炎的概述 | 第14页 |
| 1.2 类风湿性关节炎的发病机理 | 第14-17页 |
| 1.2.1 遗传因素 | 第15页 |
| 1.2.2 环境因素 | 第15-16页 |
| 1.2.3 免疫异常 | 第16页 |
| 1.2.4 感染因素 | 第16-17页 |
| 1.3 类风湿性关节炎药物治疗进展 | 第17-19页 |
| 1.3.1 非甾体类抗炎药物 | 第17页 |
| 1.3.2 糖皮质激素 | 第17-18页 |
| 1.3.3 改善病情的抗风湿药 | 第18页 |
| 1.3.4 生物制剂 | 第18-19页 |
| 1.4 类风湿性关节炎治疗上存在的问题 | 第19-20页 |
| 1.5 肿瘤坏死因子α | 第20-21页 |
| 1.6 单克隆抗体技术及其应用 | 第21-22页 |
| 1.7 基因工程抗体 | 第22-23页 |
| 1.8 本研究的目的及意义 | 第23-24页 |
| 第二章 抗hTNF-α单克隆抗体的制备、纯化及活性检测 | 第24-43页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-29页 |
| 2.2.1 细胞系 | 第24页 |
| 2.2.2 实验试剂及耗材 | 第24-25页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 | 第26-29页 |
| 2.3 试验方法 | 第29-37页 |
| 2.3.1 细胞培养方法 | 第29-30页 |
| 2.3.2 单克隆抗体的制备 | 第30-33页 |
| 2.3.3 杂交瘤细胞的染色体分析 | 第33页 |
| 2.3.4 单克隆抗体亚型检测 | 第33-34页 |
| 2.3.5 单克隆抗体的大量制备 | 第34-35页 |
| 2.3.6 单克隆抗体的纯化及亚型验证 | 第35-36页 |
| 2.3.7 单克隆抗体蛋白含量测定 | 第36页 |
| 2.3.8 单克隆抗体亲和力的测定 | 第36-37页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第37-41页 |
| 2.4.1 血清抗体滴度检测结果 | 第37-38页 |
| 2.4.2 细胞融合筛选结果 | 第38页 |
| 2.4.3 单克隆抗体亚型鉴定 | 第38-39页 |
| 2.4.4 杂交瘤细胞染色体分析结果 | 第39-40页 |
| 2.4.5 单克隆抗体的纯化 | 第40页 |
| 2.4.6 纯化后单克隆抗体的检测 | 第40-41页 |
| 2.4.7 非竞争ELISA测定单克隆抗体亲和力 | 第41页 |
| 2.5 小结 | 第41-43页 |
| 第三章 抗hTNF-α单克隆抗体可变区基因的获取及分析 | 第43-58页 |
| 3.1 引言 | 第43页 |
| 3.2 实验材料 | 第43-48页 |
| 3.2.1 细菌菌株和细胞系 | 第43页 |
| 3.2.2 工具酶及抗体 | 第43页 |
| 3.2.3 实验试剂及耗材 | 第43-44页 |
| 3.2.4 主要仪器设备 | 第44-46页 |
| 3.2.5 主要试剂的配制 | 第46-47页 |
| 3.2.6 引物 | 第47-48页 |
| 3.3 试验方法 | 第48-52页 |
| 3.3.1 细胞复苏 | 第48页 |
| 3.3.2 总RNA的提取及验证 | 第48-49页 |
| 3.3.3 轻、重链可变区基因克隆和序列分析 | 第49-52页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第52-57页 |
| 3.4.1 总RNA的抽提结果 | 第52页 |
| 3.4.2 扩增VH、VL基因 | 第52页 |
| 3.4.3 SP2/0用通用引物扩增的结果 | 第52-53页 |
| 3.4.4 VH-TA和VL-TA克隆的建立 | 第53-54页 |
| 3.4.5 可变区序列分析 | 第54-55页 |
| 3.4.6 序列信号肽分析 | 第55页 |
| 3.4.7 添加信号肽后的再次验证 | 第55-57页 |
| 3.5 小结 | 第57-58页 |
| 第四章 人鼠嵌合型Hm3E4抗体真核表达载体的构建及表达 | 第58-80页 |
| 4.1 引言 | 第58-59页 |
| 4.2 实验材料 | 第59-66页 |
| 4.2.1 细菌菌株和细胞系 | 第59页 |
| 4.2.2 工具酶及抗体 | 第59页 |
| 4.2.3 实验试剂及耗材 | 第59-60页 |
| 4.2.4 主要仪器设备 | 第60-62页 |
| 4.2.5 主要试剂的配制 | 第62-65页 |
| 4.2.6 引物 | 第65-66页 |
| 4.3 试验方法 | 第66-73页 |
| 4.3.1 构建scFv3E4-TA载体 | 第66-67页 |
| 4.3.2 pcDNA-Fc的构建 | 第67-69页 |
| 4.3.3 真核表达载体pcDNA-scFv-Fc的构建 | 第69-71页 |
| 4.3.4 人鼠嵌合型Hm3E4抗体的表达 | 第71-73页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第73-78页 |
| 4.4.1 scFv3E4-TA载体构建结果 | 第73-74页 |
| 4.4.2 pcDNA-Fc载体的构建结果 | 第74-75页 |
| 4.4.3 pcDNA-scFv-Fc载体的构建结果 | 第75-77页 |
| 4.4.4 确定CHO细胞G418的最佳筛选浓度 | 第77页 |
| 4.4.5 RT-PCR检测转然后细胞中目的基因的表达结果 | 第77页 |
| 4.4.6 SDS-PAGE及Western blot检测Hm3E4蛋白表达结果 | 第77-78页 |
| 4.5 小结 | 第78-80页 |
| 第五章 全文总结 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第86页 |
