| 目录 | 第1-10页 |
| CONTENTS | 第10-16页 |
| 摘要 | 第16-20页 |
| ABSTRACT | 第20-27页 |
| 第一章 绪论 | 第27-47页 |
| ·L-色氨酸概述 | 第27页 |
| ·L-色氨酸的应用 | 第27-29页 |
| ·医学应用 | 第28-29页 |
| ·抗抑郁症 | 第28页 |
| ·提高睡眠质量 | 第28页 |
| ·抗高血压作用 | 第28-29页 |
| ·镇痛作用 | 第29页 |
| ·食品应用 | 第29页 |
| ·饲料添加剂应用 | 第29页 |
| ·L-色氨酸的生产 | 第29-33页 |
| ·微生物转化法 | 第30页 |
| ·酶法 | 第30-31页 |
| ·直接发酵法 | 第31-33页 |
| ·L-色氨酸的微生物合成途径 | 第33-34页 |
| ·大肠杆菌L-色氨酸合成的主要限制性因素 | 第34-39页 |
| ·关键酶受到的反馈抑制 | 第34页 |
| ·转录阻遏机制 | 第34页 |
| ·前体物水平 | 第34-36页 |
| ·色氨酸弱化作用 | 第36-38页 |
| ·L-色氨酸转运系统 | 第38页 |
| ·其他的限制性因素 | 第38-39页 |
| ·提高大肠杆菌L-色氨酸产量的策略 | 第39-41页 |
| ·提高前体物的水平 | 第39-40页 |
| ·消除阻遏作用和反馈抑制 | 第40页 |
| ·提高色氨酸操纵子的表达 | 第40-41页 |
| ·改造运输系统及其他方面的改造 | 第41页 |
| ·聚羟基脂肪酸酯(PHA)概述 | 第41-45页 |
| ·PHA的结构及分类 | 第42-43页 |
| ·微生物合成PHA的途径 | 第43-44页 |
| ·PHA应用前景 | 第44-45页 |
| ·本论文的研究工作及意义 | 第45-47页 |
| 第二章 L-色氨酸基本产生菌株的构建 | 第47-70页 |
| ·实验材料 | 第48-54页 |
| ·菌株和质粒 | 第48页 |
| ·用于基因敲除和扩增的引物序列 | 第48-50页 |
| ·分子生物学常用酶 | 第50页 |
| ·常用试剂盒 | 第50页 |
| ·常用生化试剂 | 第50页 |
| ·分子量标准物 | 第50-51页 |
| ·仪器和设备 | 第51-52页 |
| ·常用试剂配方 | 第52-54页 |
| ·分子生物学常用溶液及缓冲液的配制 | 第52-53页 |
| ·培养基的配制 | 第53-54页 |
| ·抗生素及部分试剂的配制 | 第54页 |
| ·实验方法 | 第54-64页 |
| ·菌种保藏方法 | 第54页 |
| ·分子生物学常规操作 | 第54-58页 |
| ·PCR产物的回收 | 第55页 |
| ·质粒提取 | 第55-56页 |
| ·产物的胶回收 | 第56-57页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第57页 |
| ·大肠杆菌的常规转化 | 第57页 |
| ·一步法提取质粒 | 第57-58页 |
| ·大肠杆菌W3110中trpR基因的敲除 | 第58-60页 |
| ·同源重组片段的克隆 | 第58页 |
| ·电转感受态的制备 | 第58-59页 |
| ·电转化外源DNA片断 | 第59页 |
| ·重组子的筛选与验证 | 第59-60页 |
| ·质粒pKD46的去除 | 第60页 |
| ·去除W3110/△trpR菌株的卡那霉素抗性基因 | 第60页 |
| ·重组质粒pTAT的构建 | 第60-62页 |
| ·trpE基因的扩增及定点突变 | 第60-61页 |
| ·pCL1920-trpE载体的构建 | 第61页 |
| ·aroG基因的定点突变 | 第61-62页 |
| ·pCL1920-trpE3-aroG载体的构建 | 第62页 |
| ·pCL1920-trpE3-aroGl-tktA载体的构建 | 第62页 |
| ·基本发酵菌株GPT1001的构建 | 第62页 |
| ·发酵方法 | 第62-63页 |
| ·种子培养 | 第62页 |
| ·分批发酵培养 | 第62-63页 |
| ·5-1发酵罐发酵 | 第63页 |
| ·检测方法 | 第63-64页 |
| ·L-色氨酸的检测方法 | 第63页 |
| ·葡萄糖浓度的测定 | 第63页 |
| ·细菌生长情况检测 | 第63-64页 |
| ·发酵产物和副产物的检测 | 第64页 |
| ·结果与讨论 | 第64-69页 |
| ·L-色氨酸标准曲线的建立 | 第64-65页 |
| ·L-色氨酸基本发酵菌株的构建 | 第65-69页 |
| ·大肠杆菌W3110中trpR, tnaA和ptsG基因的敲除 | 第65-66页 |
| ·aroG与trpE基因的定点突变 | 第66-67页 |
| ·重组质粒pTAT及GPT1001菌株的构建 | 第67-68页 |
| ·GPT1001菌株的发酵检测 | 第68-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 第三章 一步法完成色氨酸衰减子的敲除及多拷贝启动子的替换 | 第70-82页 |
| ·材料与方法 | 第72-76页 |
| ·菌株和质粒 | 第72页 |
| ·用于基因操作的引物序列 | 第72页 |
| ·pKMT质粒的构建 | 第72页 |
| ·一步法完成色氨酸衰减子的敲除以及野生型色氨酸启动子的替换 | 第72-76页 |
| ·RT-PCR检测 | 第76页 |
| ·菌株发酵 | 第76页 |
| ·检测方法 | 第76页 |
| ·实验结果与讨论 | 第76-81页 |
| ·一步法完成色氨酸衰减子的敲除和启动子置换 | 第76-78页 |
| ·GPT1002中色氨酸操纵子的转录水平 | 第78-79页 |
| ·GPT1002 L-色氨酸产量的发酵检测 | 第79-81页 |
| ·本章小结 | 第81-82页 |
| 第四章 L-色氨酸透过酶的敲除对L-色氨酸产量的影响 | 第82-93页 |
| ·材料与方法 | 第83-86页 |
| ·菌株和质粒 | 第83页 |
| ·用于基因操作的引物序列 | 第83页 |
| ·大肠杆菌L-色氨酸透过酶的敲除 | 第83页 |
| ·菌株发酵 | 第83页 |
| ·检测方法 | 第83-86页 |
| ·L-色氨酸吸收检测 | 第86页 |
| ·RT-PCR检测 | 第86页 |
| ·实验结果与讨论 | 第86-92页 |
| ·L-色氨酸透过酶的敲除对大肠杆菌L-色氨酸吸收的影响 | 第86-87页 |
| ·L-色氨酸透过酶的敲除对大肠杆菌生理状态的影响 | 第87-89页 |
| ·L-色氨酸透过酶缺失菌株的发酵检测 | 第89-91页 |
| ·L-色氨酸透过酶敲除菌株的中心代谢途径关键基因的RT-PCR检测 | 第91-92页 |
| ·本章小结 | 第92-93页 |
| 第五章 PHB的合成对重组大肠杆菌L-色氨酸产量的影响 | 第93-103页 |
| ·实验材料与方法 | 第94-97页 |
| ·菌株和质粒 | 第94-95页 |
| ·用于基因操作的引物序列 | 第95页 |
| ·pMCABK质粒的构建 | 第95-96页 |
| ·菌株发酵 | 第96页 |
| ·检测方法 | 第96-97页 |
| ·RT-PCR检测 | 第97页 |
| ·实验结果与讨论 | 第97-102页 |
| ·重组大肠杆菌GPT1002中PHB合成途径的构建 | 第97-98页 |
| ·PHB的积累对色氨酸操纵子转录水平的影响 | 第98-99页 |
| ·采用木糖和葡萄糖作为混合碳源提高L-色氨酸和PHB的产量 | 第99-102页 |
| ·本章小结 | 第102-103页 |
| 第六章 利用FLP/FRT位点专一性重组系统实现大肠杆菌基因组随机拷贝数基因的整合 | 第103-121页 |
| ·实验材料与方法 | 第107-110页 |
| ·菌株和质粒 | 第107-108页 |
| ·用于基因操作的引物序列 | 第108-109页 |
| ·recA基因的敲除 | 第109页 |
| ·整合质粒pTKG的构建 | 第109页 |
| ·在基因组上整合随机拷贝数基因 | 第109页 |
| ·aroK基因的整合 | 第109-110页 |
| ·RT-PCR检测 | 第110页 |
| ·菌株发酵 | 第110页 |
| ·检测方法 | 第110页 |
| ·实验结果与讨论 | 第110-120页 |
| ·recA基因的敲除与pTKG质粒的构建 | 第110-111页 |
| ·GPT102T基因组整合随机拷贝数的pTKG质粒 | 第111-114页 |
| ·恢复培养时间的优化 | 第114-116页 |
| ·基因组上FRT位点个数对基因整合拷贝数的影响 | 第116-117页 |
| ·GPT102T基因组上整合随机拷贝数的aroK基因 | 第117-120页 |
| ·本章小结 | 第120-121页 |
| 全文总结 | 第121-124页 |
| 参考文献 | 第124-136页 |
| 致谢 | 第136-138页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第138-139页 |
| 外文写作 | 第139-164页 |
| 外文论文一 | 第141-150页 |
| 外文论文二 | 第150-157页 |
| 外文论文三 | 第157-164页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第164页 |
