| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 引言 | 第11-13页 |
| 第一部分 前言 | 第13-20页 |
| 1 IBDV的结构及其基因组 | 第13页 |
| 2 IBDV的衣壳蛋白 | 第13-15页 |
| 3 IBDV的转录、复制、装配与释放 | 第15-16页 |
| 4 IBDV的致病机理 | 第16-17页 |
| 5 IBDV的毒力变化与细胞适应性 | 第17-20页 |
| ·VP2与病毒毒力 | 第17-18页 |
| ·VP2与病毒的细胞适应性 | 第18-20页 |
| 第二部分 IBDV VP2基因片段的噬菌体展示及重组噬菌体与细胞的结合鉴定 | 第20-45页 |
| 1 材料与方法 | 第20-29页 |
| ·VP2基因、载体 | 第20-21页 |
| ·试剂配制 | 第21页 |
| ·VP2基因的扩增 | 第21页 |
| ·VP2基因的克隆 | 第21-24页 |
| ·PCR产物回收 | 第21-22页 |
| ·大肠杆菌JM109感受态的制备 | 第22页 |
| ·转化 | 第22页 |
| ·阳性转化子的筛选与鉴定 | 第22-24页 |
| ·序列测定与分析 | 第24页 |
| ·VP2基因分段 | 第24-25页 |
| ·VP2基因及其片段的噬菌体包装 | 第25-26页 |
| ·VP2基因及其片段的酶切与回收 | 第25页 |
| ·噬菌体包装 | 第25-26页 |
| ·重组噬菌体的滴度测定 | 第26页 |
| ·重组噬菌体的鉴定 | 第26-27页 |
| ·重组噬菌体的PCR鉴定 | 第26-27页 |
| ·序列测定 | 第27页 |
| ·重组噬菌体扩大培养及纯化 | 第27-28页 |
| ·噬菌体的扩大培养与保存 | 第27页 |
| ·重组噬菌体的纯化 | 第27页 |
| ·纯化噬菌体的鉴定 | 第27-28页 |
| ·重组噬菌体的FITC标记 | 第28页 |
| ·荧光标记的重组噬菌体与IBDV易感细胞的结合 | 第28-29页 |
| ·鸡法氏囊B细胞,Vero细胞的制备 | 第28-29页 |
| ·B细胞、Vero细胞与FITC标记噬菌体的结合 | 第29页 |
| 2 结果 | 第29-40页 |
| ·VP2基因的扩增 | 第29-30页 |
| ·重组质粒PCR与酶切鉴定 | 第30页 |
| ·VP2基因的分段 | 第30-31页 |
| ·噬菌体包装及重组噬菌体鉴定 | 第31-32页 |
| ·噬菌体纯化结果 | 第32-33页 |
| ·噬菌体FITC标记结果 | 第33-34页 |
| ·荧光标记重组噬菌体于B细胞的结合 | 第34-37页 |
| ·荧光标记的重组噬菌体与B细胞涂片结合的荧光检测 | 第34-35页 |
| ·荧光标记的重组噬菌体与B细胞悬液结合的流式细胞分析 | 第35-37页 |
| ·荧光标记重组噬菌体于Vero细胞的结合 | 第37-40页 |
| ·荧光标记的重组噬菌体与Vero细胞涂片结合的荧光检测 | 第37-38页 |
| ·荧光标记的重组噬菌体与B细胞悬液结合的流式细胞分析 | 第38-40页 |
| 3 讨论 | 第40-45页 |
| ·VP2蛋白的分段 | 第40-42页 |
| ·荧光标记的重组噬菌体制备 | 第42-43页 |
| ·荧光噬菌体与B细胞及Vero细胞的结合 | 第43-45页 |
| 第三部分 VP2基因片段与的GFP融合分子在COS7细胞中的表达及与细胞的结合鉴定 | 第45-60页 |
| 1 材料与方法 | 第45-52页 |
| ·细胞、质粒和试剂 | 第45-46页 |
| ·真核表达质粒pGFP-VP2/B/B1/B2/B3的构建 | 第46-48页 |
| ·VP2基因及其片段的扩增 | 第46-47页 |
| ·VP2基因片段的克隆 | 第47-48页 |
| ·细胞瞬时转染 | 第48-50页 |
| ·质粒制备 | 第48-49页 |
| ·COS7细胞培养和转染 | 第49-50页 |
| ·荧光显微镜下观察和照相 | 第50页 |
| ·细胞稳定转染 | 第50-51页 |
| ·G418工作浓度的确定 | 第50页 |
| ·质粒制备 | 第50页 |
| ·细胞转染 | 第50-51页 |
| ·阳性细胞的克隆化 | 第51页 |
| ·细胞冻存 | 第51页 |
| ·表达蛋白收集与纯化 | 第51页 |
| ·表达蛋白纯化 | 第51页 |
| ·纯化蛋白与IBDV易感细胞的结合 | 第51-52页 |
| 2 结果 | 第52-57页 |
| ·VP2及其片段的PCR扩增 | 第52页 |
| ·重组载体pGFP-VP2/B/B1/B2/B3的鉴定 | 第52-53页 |
| ·重组质粒在COS7细胞中的瞬时表达 | 第53-54页 |
| ·重组质粒在COS7细胞中的稳定表达 | 第54-55页 |
| ·GFP-VP2与GFP-B融合蛋白的纯化及鉴定 | 第55-56页 |
| ·纯化蛋白与IBDV易感细胞的结合 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-60页 |
| ·GFP融合蛋白 | 第57页 |
| ·COS7细胞 | 第57页 |
| ·细胞转染及稳定表达外源蛋白细胞系的建立 | 第57-58页 |
| ·融合蛋白的纯化及与细胞的结合实验 | 第58-60页 |
| 第四部分 重叠多肽扫描鉴定VP2与细胞结合表位 | 第60-72页 |
| 1 材料与方法 | 第60-62页 |
| ·主要仪器 | 第60页 |
| ·多肽的合成 | 第60-61页 |
| ·VP2重叠多肽设计 | 第60-61页 |
| ·VP2重叠多肽合成 | 第61页 |
| ·多肽对荧光标记的T7-VP2结合细胞的抑制 | 第61-62页 |
| ·细胞制备 | 第61页 |
| ·细胞结合抑制多肽的筛选 | 第61页 |
| ·阳性多肽抑制浓度的确定 | 第61-62页 |
| 2 结果 | 第62-69页 |
| ·多肽设计与合成 | 第62页 |
| ·多肽对荧光标记的T7-VP2结合细胞的抑制 | 第62-69页 |
| ·多肽对B细胞结合T7-VP2的抑制 | 第62-65页 |
| ·多肽对Vero细胞结合T7-VP2的抑制 | 第65-67页 |
| ·阳性肽抑制浓度的筛选 | 第67-69页 |
| 3 讨论 | 第69-72页 |
| ·多肽的设计、合成与检测 | 第69-70页 |
| ·合成多肽与细胞的结合鉴定 | 第70-72页 |
| 全文总结 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 | 第79页 |
