| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-15页 |
| 缩略语表 | 第15-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-47页 |
| 1 禽流感和禽流感病毒研究进展 | 第17-35页 |
| ·禽流感的流行和危害 | 第17-21页 |
| ·国外禽流感的流行现状 | 第17-18页 |
| ·国内禽流感的流行现状 | 第18-19页 |
| ·禽流感的危害 | 第19-21页 |
| ·禽流感病毒及其特性 | 第21-24页 |
| ·禽流感病毒的形态和结构 | 第21页 |
| ·禽流感病毒的理化特性 | 第21-22页 |
| ·禽流感病毒的复制 | 第22页 |
| ·禽流感病毒的宿主特异性 | 第22-23页 |
| ·禽流感病毒的免疫原性 | 第23-24页 |
| ·禽流感病毒的分子生物学 | 第24-29页 |
| ·病毒基因编码蛋白的结构和功能 | 第24-28页 |
| ·禽流感病毒的分子进化 | 第28页 |
| ·禽流感病毒宿主间跨越的分子基础 | 第28-29页 |
| ·禽流感的检测方法 | 第29-32页 |
| ·病毒的分离鉴定 | 第29页 |
| ·凝(HA)和血凝抑制(HI)试验 | 第29-30页 |
| ·神经氨酸酶抑制试验(NIT) | 第30页 |
| ·琼脂凝胶扩散试验(AGID) | 第30页 |
| ·病毒中和试验(NT) | 第30页 |
| ·免疫荧光技术(IFT) | 第30-31页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第31页 |
| ·分子生物学诊断技术 | 第31-32页 |
| ·禽流感病毒的致病机制 | 第32-35页 |
| ·禽流感病毒的毒力 | 第32页 |
| ·禽流感病毒与细胞凋亡 | 第32-35页 |
| 2 动物的抗病毒机制 | 第35-41页 |
| ·抗病毒的特异性免疫应答 | 第35-36页 |
| ·非特异性免疫细胞 | 第36-37页 |
| ·干扰素抗病毒机制 | 第37-41页 |
| ·干扰素的种类和特性 | 第37页 |
| ·干扰素抗病毒的分子机制 | 第37-38页 |
| ·IFN刺激基因的诱导和调控 | 第38页 |
| ·IFN诱导ISG的途径 | 第38-39页 |
| ·IFN诱导的抗病毒蛋白 | 第39-41页 |
| 3 流感病毒感染过程中宿主的应答基因 | 第41-42页 |
| 4 差异表达基因的筛选方法及其应用 | 第42-45页 |
| ·差异表达基因的筛选方法 | 第42-44页 |
| ·消减杂交法 | 第42页 |
| ·mRNA差异显示 | 第42-43页 |
| ·代表性差别分析法 | 第43页 |
| ·抑制性差减杂交 | 第43-44页 |
| ·抑制性差减杂交技术在筛选疾病相关基因中的应用 | 第44-45页 |
| 5 本研究的目的、意义和试验总体设计 | 第45-47页 |
| 第二章 禽流感病毒原位杂交检测方法的建立 | 第47-61页 |
| 1 材料与方法 | 第48-53页 |
| ·主要仪器 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48-49页 |
| ·病毒 | 第49页 |
| ·细胞 | 第49页 |
| ·核酸探针的制备 | 第49-51页 |
| ·引物设计合成 | 第49页 |
| ·禽流感病毒RNA提取 | 第49-50页 |
| ·RT-PCR扩增NP基因片段 | 第50页 |
| ·DNA片段的回收 | 第50-51页 |
| ·地高辛标记NP基因片段 | 第51页 |
| ·探针标记效率与灵敏度测定 | 第51页 |
| ·探针特异性鉴定 | 第51页 |
| ·细胞涂片的制备 | 第51-52页 |
| ·细胞培养与病毒感染 | 第51页 |
| ·载玻片的准备 | 第51-52页 |
| ·细胞收集与涂片 | 第52页 |
| ·细胞接毒后病毒检测 | 第52页 |
| ·原位杂交 | 第52-53页 |
| ·细胞的固定 | 第52页 |
| ·蛋白酶K消化 | 第52页 |
| ·DNA酶消化 | 第52页 |
| ·原位杂交 | 第52-53页 |
| ·原位杂交方法的重复性试验 | 第53页 |
| 2 结果与分析 | 第53-57页 |
| ·禽流感病毒NP基因片段的RT-PCR扩增结果 | 第53页 |
| ·地高辛标记效率与灵敏度检测结果 | 第53页 |
| ·探针特异性检验 | 第53-54页 |
| ·MDCK细胞接毒后的检测 | 第54-55页 |
| ·禽流感病毒的细胞内原位杂交检测 | 第55-57页 |
| ·原位杂交方法的重复性试验 | 第57页 |
| 3 讨论 | 第57-60页 |
| ·禽流感病毒原位杂交检测方法的建立及其意义 | 第57-59页 |
| ·原位杂交方法的影响因素 | 第59-60页 |
| ·原位杂交标本的固定 | 第59页 |
| ·原位杂交标本组织的通透性处理 | 第59-60页 |
| ·原位杂交的探针制备 | 第60页 |
| 4 小结 | 第60-61页 |
| 第三章 禽流感病毒感染鸡的病毒定位 | 第61-69页 |
| 1 材料与方法 | 第62-64页 |
| ·主要仪器 | 第62页 |
| ·试剂 | 第62页 |
| ·病毒 | 第62页 |
| ·试验动物 | 第62页 |
| ·病毒增殖 | 第62-63页 |
| ·病毒半数感染量的测定 | 第63页 |
| ·动物感染试验 | 第63页 |
| ·组织样品的采集与固定 | 第63页 |
| ·石蜡组织切片的制备 | 第63-64页 |
| ·载玻片和盖玻片的处理 | 第63页 |
| ·组织包埋 | 第63页 |
| ·组织切片的制备 | 第63-64页 |
| ·禽流感病毒NP基因核酸探针的制备 | 第64页 |
| ·原位杂交 | 第64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-66页 |
| ·禽流感病毒感染后的鸡的临床症状及剖检变化 | 第64-65页 |
| ·原位杂交结果 | 第65-66页 |
| 3 讨论 | 第66-68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 第四章 鸡对禽流感病毒感染应答基因的筛选与鉴定 | 第69-111页 |
| 1 材料与方法 | 第70-85页 |
| ·主要仪器 | 第70页 |
| ·试剂 | 第70页 |
| ·试验动物 | 第70页 |
| ·病毒 | 第70-71页 |
| ·动物饲养与病毒感染 | 第71页 |
| ·试验组织样本的采集 | 第71页 |
| ·组织总RNA的提取 | 第71页 |
| ·mRNA的分离 | 第71-72页 |
| ·SMART cDNA的合成 | 第72-74页 |
| ·差减cDNA文库构建 | 第74-80页 |
| ·Driver和Tester cDNA的制备 | 第74-77页 |
| ·差减杂交 | 第77-78页 |
| ·PCR扩增 | 第78页 |
| ·Tester cDNA的接头连接效率和文库差减效率的检测 | 第78-79页 |
| ·差减cDNA质粒文库的构建 | 第79-80页 |
| ·差减cDNA克隆的筛选 | 第80-82页 |
| ·PCR筛选 | 第80-81页 |
| ·斑点杂交筛选 | 第81-82页 |
| ·阳性克隆cDNA片段测序及序列分析 | 第82页 |
| ·RT-PCR检验差异表达基因 | 第82-83页 |
| ·差异表达基因引物的设计与合成 | 第82页 |
| ·RT-PCR检验 | 第82-83页 |
| ·Northern杂交检验差异表达基因 | 第83-84页 |
| ·探针标记 | 第83-84页 |
| ·甲醛变性电泳分离RNA | 第84页 |
| ·转膜 | 第84页 |
| ·杂交 | 第84页 |
| ·ISG12和LY6E基因在禽流感病毒感染鸡不同组织中的表达分析 | 第84-85页 |
| ·ISG12和LY6E基因克隆及序列分析 | 第85页 |
| ·ISG12和LY6E基因克隆 | 第85页 |
| ·ISG12和LY6E基因序列的分析 | 第85页 |
| 2 结果与分析 | 第85-100页 |
| ·组织总RNA的提取 | 第85页 |
| ·mRNA的分离 | 第85-87页 |
| ·Driver cDNA和Tester cDNA的制备 | 第87-88页 |
| ·鸡对禽流感病毒感染应答基因差减cDNA文库的构建 | 第88-89页 |
| ·差减cDNA文库的差减效率检测 | 第89-90页 |
| ·差减cDNA克隆的筛选 | 第90页 |
| ·PCR筛选 | 第90页 |
| ·斑点杂交筛选 | 第90页 |
| ·阳性克隆cDNA片段测序及序列分析 | 第90-92页 |
| ·差异表达基因的RT-PCR检验和Northern杂交检测 | 第92-93页 |
| ·Northern杂交检验ISG12和LY6E基因在鸡的不同组织中的表达 | 第93-95页 |
| ·鸡ISG12和Lv6E基因克隆及序列分析 | 第95-100页 |
| ·鸡ISG12基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的分析 | 第95页 |
| ·鸡ISG12蛋白分子进化树分析 | 第95-98页 |
| ·鸡LY6E基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的分析 | 第98-99页 |
| ·鸡LY6E蛋白分子进化树分析 | 第99-100页 |
| 3 讨论 | 第100-110页 |
| ·鸡禽流感病毒感染应答基因的筛选鉴定及其意义 | 第100-107页 |
| ·ISG12基因 | 第101-102页 |
| ·LY6E基因 | 第102-103页 |
| ·溶菌酶基因 | 第103页 |
| ·基质Gla蛋白基因 | 第103-104页 |
| ·谷光苷肽转移酶基因 | 第104-105页 |
| ·葡萄糖6磷酸酶催化亚基基因 | 第105页 |
| ·酒精脱氢酶基因 | 第105-106页 |
| ·突触结合蛋白基因 | 第106页 |
| ·钠／二羧酸转运蛋白基因 | 第106页 |
| ·禽流感病毒感染鸡的机制 | 第106-107页 |
| ·抑制性差减杂交技术的应用 | 第107-110页 |
| ·抑制性差减杂交技术在筛选疾病相关基因中的应用 | 第107-108页 |
| ·应用SSH筛选鸡对禽流感病毒感染的应答基因 | 第108-109页 |
| ·鸡对禽流感病毒感染应答基因的鉴定以及cDNA序列的完整性 | 第109-110页 |
| ·RT-PCR分析宿主应答基因的表达 | 第110页 |
| 4 小结 | 第110-111页 |
| 第五章 禽流感病毒NS1蛋白与鸡差异表达蛋白间的相互作用 | 第111-139页 |
| 1 材料与方法 | 第112-122页 |
| ·主要仪器 | 第112页 |
| ·试剂 | 第112-113页 |
| ·质粒 | 第113-115页 |
| ·pBT质粒 | 第113页 |
| ·pTRG质粒 | 第113-115页 |
| ·对照质粒 | 第115页 |
| ·重组诱饵质粒的构建 | 第115-118页 |
| ·NS1基因的克隆 | 第115-117页 |
| ·插入片段的准备 | 第117页 |
| ·诱饵质粒和插入片段的连接和转化 | 第117-118页 |
| ·阳性转化子的验证 | 第118页 |
| ·NS1蛋白和λ噬菌体阻遏蛋白λcI融合蛋白的诱导表达 | 第118页 |
| ·重组目标质粒的构建 | 第118-120页 |
| ·LY6E和ISG12基因的克隆 | 第118-119页 |
| ·插入片段及目标质粒的准备 | 第119页 |
| ·目标质粒和插入片段的连接与转化 | 第119页 |
| ·阳性转化子的验证 | 第119页 |
| ·ISG12、LY6E蛋白和RNA聚合酶a-亚基氨基末端融合蛋白的诱导表达 | 第119-120页 |
| ·重组诱饵质粒和目标质粒的共转化 | 第120-122页 |
| ·重组诱饵质粒和目标质粒的制备 | 第120页 |
| ·重组诱饵质粒和目标质粒的共转化 | 第120-121页 |
| ·阳性共转化子的鉴定 | 第121页 |
| ·阳性共转化子的第一轮筛选 | 第121页 |
| ·阳性共转化子第二轮筛选 | 第121-122页 |
| 2 结果 | 第122-134页 |
| ·重组诱饵质粒的构建 | 第122-125页 |
| ·NS1基因的RT-PCR扩增、克隆与鉴定 | 第122页 |
| ·NS1基因的序列分析 | 第122-123页 |
| ·重组诱饵质粒的构建 | 第123-125页 |
| ·NS1蛋白和λ噬菌体阻遏蛋白λcI融合蛋白的诱导表达 | 第125页 |
| ·重组目标质粒的构建 | 第125-130页 |
| ·LY6E和ISG12基因的PCR扩增及克隆 | 第126页 |
| ·LY6E和ISG12基因的序列测定 | 第126-127页 |
| ·目标质粒与LY6E、ISG12基因片段的连接与转化 | 第127-128页 |
| ·转化子的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第128-129页 |
| ·ISG12、LY6E蛋白和RNA聚合酶a-亚基氨基末端融合蛋白的诱导表达 | 第129-130页 |
| ·重组诱饵质粒和重组目标质粒的共转化 | 第130-132页 |
| ·阳性共转化子的筛选 | 第132-134页 |
| 3 讨论 | 第134-138页 |
| ·NS1蛋白和ISG12蛋白、LY6E蛋白之间的相互作用 | 第134-136页 |
| ·关于细菌双杂交系统 | 第136-138页 |
| 4 小结 | 第138-139页 |
| 总结 | 第139-140页 |
| 参考文献 | 第140-159页 |
| 致谢 | 第159-160页 |
| 在读期间发表论文 | 第160页 |
