| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-15页 |
| 1 绪论 | 第15-32页 |
| ·研究背景 | 第15-23页 |
| ·蝗灾严重威胁着全世界农作物的生产 | 第15-16页 |
| ·国内外蝗虫生物防治研究进展 | 第16-20页 |
| ·绿僵菌杀蝗剂的优点及在研发和应用中存在的问题 | 第20-21页 |
| ·海藻糖是生物体内的抗逆境剂 | 第21页 |
| ·真菌海藻糖酶研究进展 | 第21-23页 |
| ·研究目的和意义 | 第23页 |
| ·研究目标和整体设计 | 第23-24页 |
| ·研究目标 | 第23-24页 |
| ·研究思路构架 | 第24页 |
| ·研究内容和技术路线 | 第24-31页 |
| ·金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及表达特性分析 | 第24-26页 |
| ·金龟子绿僵菌NTL 超表达载体的构建 | 第26-27页 |
| ·金龟子绿僵菌NTL 同源置换载体的构建 | 第27-28页 |
| ·金龟子绿僵菌NTL RNA 干扰载体的构建 | 第28-30页 |
| ·NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌原生质体 | 第30-31页 |
| ·NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌分生孢子 | 第31页 |
| ·转化子和出发菌株在分子生物学及生理生化特性上的比较分析 | 第31页 |
| ·本研究的创新性 | 第31-32页 |
| 2 材料和方法 | 第32-61页 |
| ·金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及表达特性分析 | 第32-45页 |
| ·试验菌株与质粒 | 第32页 |
| ·主要仪器设备 | 第32页 |
| ·主要试剂 | 第32-33页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 总DNA 的提取 | 第33-34页 |
| ·CQMa102 NTL 同源片段的PCR 扩增、克隆及序列测定 | 第34-36页 |
| ·利用5’RACE 和3’RACE 克隆NTL 基因5’端和3’端cDNA 序列 | 第36-39页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因组全长的PCR 扩增和克隆 | 第39-40页 |
| ·NTL 基因上游序列的panhandle PCR 扩增、克隆、测序及验证 | 第40-43页 |
| ·金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因表达特性分析 | 第43-45页 |
| ·NTL 基因超表达载体、同源置换载体、RNA 干扰载体的构建 | 第45-51页 |
| ·试验菌株与质粒 | 第45页 |
| ·主要仪器设备 | 第45页 |
| ·主要试剂 | 第45页 |
| ·金龟子绿僵菌NTL 超表达载体的构建 | 第45-47页 |
| ·金龟子绿僵菌NTL 同源置换载体的构建 | 第47-49页 |
| ·金龟子绿僵菌RNA 干扰载体的构建 | 第49-51页 |
| ·NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌原生质体 | 第51-55页 |
| ·试验菌株和质粒 | 第51页 |
| ·主要仪器设备 | 第51页 |
| ·主要试剂 | 第51-52页 |
| ·金龟子绿僵菌原生质体的制备 | 第52页 |
| ·NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体的酶切 | 第52-53页 |
| ·CaCl_2/PEG 介导法转化金龟子绿僵菌原生质体 | 第53页 |
| ·电激法转化金龟子绿僵菌原生质体 | 第53页 |
| ·稳定转化子的筛选 | 第53页 |
| ·金龟子绿僵菌原生质体对潮霉素B(hygromycin B)的抗性实验 | 第53-54页 |
| ·金龟子绿僵菌原生质体对苯莱特(benomyl)的抗性实验 | 第54页 |
| ·短片段同源置换载体转化子的抗性和PCR 筛选 | 第54页 |
| ·长片段同源置换、超表达和RNA 干扰载体转化子的抗性和PCR 筛选 | 第54-55页 |
| ·NTL 超表达、长片段同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌分生孢子 | 第55-57页 |
| ·试验菌株和质粒 | 第55页 |
| ·主要仪器设备 | 第55页 |
| ·主要试剂 | 第55-56页 |
| ·金龟子绿僵菌分生孢子的培养、收集和预处理 | 第56页 |
| ·外源质粒DNA 包被于金粉内 | 第56页 |
| ·基因枪法转化金龟子绿僵菌分生孢子 | 第56-57页 |
| ·稳定转化子的筛选 | 第57页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 分生孢子对苯莱特的抗性实验 | 第57页 |
| ·超表达、长片段同源置换和RNA 干扰载体转化子的抗性和PCR 筛选 | 第57页 |
| ·超表达和RNA 干扰载体转化子的Southern 杂交验证 | 第57页 |
| ·转化子与出发菌株在分子生物学和生理生化特性上的比较分析 | 第57-61页 |
| ·试验菌株 | 第57页 |
| ·主要仪器设备 | 第57-58页 |
| ·主要试剂 | 第58页 |
| ·对数生长期NTL mRNA 表达量比较分析 | 第58页 |
| ·转化菌株和出发菌株孢子内海藻糖含量的测定 | 第58-59页 |
| ·转化菌株和出发菌株孢子耐贮性的比较分析 | 第59页 |
| ·转化菌株和出发菌株孢子耐热性的比较分析 | 第59页 |
| ·转化菌株和出发菌株生长特性的比较 | 第59-61页 |
| 3 结果与分析 | 第61-97页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因同源片段的克隆和分析 | 第61-64页 |
| ·NTL 基因同源片段的扩增结果 | 第61页 |
| ·NTL 基因同源片段的测序结果 | 第61-62页 |
| ·NTL 基因同源片段A 的序列分析 | 第62-64页 |
| ·5’RACE 和3’RACE 克隆NTL 基因5’端和3’端cDNA 序列 | 第64-65页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因的克隆和分析 | 第65-68页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因上游调控序列的克隆和分析 | 第68-69页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因的Southern 杂交分析 | 第69-70页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因的表达特性分析 | 第70-71页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 超表达载体的构建、超表达转化子的筛选和鉴定 | 第71-78页 |
| ·NTL 超表达载体的构建和鉴定 | 第71-73页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 原生质体的制备 | 第73-74页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 原生质体对苯莱特的抗性实验 | 第74页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 分生孢子对苯莱特的抗性实验 | 第74页 |
| ·NTL 超表达转化子的筛选 | 第74-77页 |
| ·NTL 超表达转化子的Southern blot 鉴定 | 第77-78页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 短片段同源置换载体的构建、同源置换转化子的筛选 | 第78-81页 |
| ·NTL 短片段同源置换载体的构建和鉴定 | 第78-79页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 原生质体对潮霉素B 的抗性实验 | 第79页 |
| ·NTL 短片段同源置换转化子的筛选 | 第79-81页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 长片段同源置换载体的构建、同源置换转化子的筛选 | 第81-83页 |
| ·NTL 长片段同源置换载体的构建和鉴定 | 第81-82页 |
| ·NTL 长片段同源置换转化子的筛选 | 第82-83页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 NTL RNA 干扰载体的构建、干扰载体转化子的筛选和鉴定 | 第83-87页 |
| ·RNA 干扰载体的构建和鉴定 | 第83-84页 |
| ·RNA 干扰载体转化子的筛选 | 第84-86页 |
| ·RNA 干扰转化子的Southern blot 鉴定 | 第86-87页 |
| ·转化菌株和出发菌株在对数生长期的NTL mRNA 表达量比较分析 | 第87-88页 |
| ·转化菌株Ma688、 Ma113 和出发菌株孢子内海藻糖含量的测定 | 第88-89页 |
| ·转化菌株Ma688、Ma113 和出发菌株孢子耐贮性的比较分析 | 第89-93页 |
| ·转化菌株Ma688、 Ma113 和出发菌株孢子耐热性的比较分析 | 第93-94页 |
| ·转化菌株和出发菌株生长特性的比较 | 第94-97页 |
| ·在1/4SDA 平板上的生长情况 | 第94-95页 |
| ·在固体培养基上的产孢率比较分析 | 第95-97页 |
| 4 讨论 | 第97-111页 |
| ·真菌的遗传转化方法及其评价 | 第97-100页 |
| ·以PEG 等化学物质介导的遗传转化 | 第97页 |
| ·以限制酶介导的遗传转化 | 第97-98页 |
| ·以根癌农杆菌介导的遗传转化 | 第98-99页 |
| ·电激法 | 第99页 |
| ·基因枪法 | 第99页 |
| ·显微注射法 | 第99-100页 |
| ·激光微束穿孔法 | 第100页 |
| ·基因打靶的策略及其评价 | 第100-105页 |
| ·RNA 干扰技术使基因敲低或基因沉默 | 第105-108页 |
| ·RNA 干扰的发现和发展 | 第105-106页 |
| ·RNA 干扰可能的作用机制 | 第106-107页 |
| ·RNA 干扰技术在功能基因组研究中的应用 | 第107页 |
| ·RNA 干扰技术的缺陷 | 第107-108页 |
| ·金龟子绿僵菌孢子内海藻糖含量与孢子耐贮性的关系 | 第108页 |
| ·中性海藻糖酶与孢子耐贮性、耐热性的关系 | 第108-111页 |
| 5 结论 | 第111-113页 |
| 致谢 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-127页 |
| 附录1 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录 | 第127-129页 |
| 附录2 测序结果 | 第129-141页 |
| 独创性声明 | 第141页 |
| 学位论文版权使用授权书 | 第141页 |
