| 前言 | 第1-7页 |
| 第一部分 AAV-hVEGF_(165)的构建 | 第7-29页 |
| 材料和方法 | 第7-22页 |
| 一、材料 | 第7-8页 |
| 1.质粒、细菌和细胞 | 第7页 |
| 2.实验仪器及试剂 | 第7-8页 |
| 二、方法 | 第8-22页 |
| 1.hVEGF_(165)基因的获取 | 第8-11页 |
| ·hVEGF_(165)引物设计及合成 | 第8-9页 |
| ·聚合酶链反应(PCR)扩增hVEGF_(165) | 第9-10页 |
| ·hVEGF_(165)的大反应体系(200μ1)PCR反应产物的酶切与纯化 | 第10-11页 |
| 2.穿梭质粒pSNAV的获取和鉴定 | 第11-15页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备和pSNAV的转化 | 第11-12页 |
| ·碱裂解法小量提取质粒pSNAV—用于酶切 | 第12-13页 |
| ·pSNAV的酶切鉴定 | 第13页 |
| ·碱裂解法大提pSNAV | 第13-14页 |
| ·pSNAV的酶切与纯化 | 第14-15页 |
| 3.pSNAV-hVEGF_(165)的构建及鉴定 | 第15-18页 |
| ·纯化后质粒pSNAV和hVEGF_(165)片断的连接反应 | 第15页 |
| ·连接产物pSNAV-hVEGF_(165)的扩增 | 第15-18页 |
| 4.人胚肾293细胞(HEK293)的培养 | 第18-19页 |
| ·HEK293细胞的复苏 | 第18-19页 |
| ·HEK293细胞的传代 | 第19页 |
| ·HEK293细胞的计数 | 第19页 |
| 5.脂质体介导的pSNAV-hVEGF_(165)转染HEK293细胞 | 第19-20页 |
| 6.pSNAV-hVEGF_(165)的免疫荧光组化 | 第20页 |
| 7.血管内皮细胞(VEC)的培养 | 第20-21页 |
| ·VEC的复苏 | 第21页 |
| ·VEC的传代及计数 | 第21页 |
| 8.MTT法测定hVEGF_(165)蛋白活性 | 第21页 |
| 9.AAV-hVEGF_(165)的包装 | 第21-22页 |
| 结果 | 第22-29页 |
| ·hVEGF_(165)PCR扩增产物 | 第22页 |
| ·质粒pSNAV的酶切鉴定 | 第22-23页 |
| ·pSNAV-VEGF_(165)构建及鉴定 | 第23-26页 |
| ·HEK293细胞的培养 | 第26页 |
| ·脂质体介导pSNAV-hVEGF_(165)转染后的HEK293细胞 | 第26页 |
| ·pSNAV-hVEGF_(165)的免疫荧光组化 | 第26-27页 |
| ·VEC的培养 | 第27-28页 |
| ·MTT法测定hVEGF_(165)蛋白活性 | 第28页 |
| ·AAV-hVEGF_(165)的包装结果 | 第28-29页 |
| 第二部分 hVEGF_(165)与TGFβ1对椎间盘纤维环细胞的生物学效应 | 第29-40页 |
| 材料和方法 | 第29-36页 |
| 一、材料 | 第29页 |
| 1.病毒载体和细胞 | 第29页 |
| 2.实验仪器及试剂 | 第29页 |
| 二、方法 | 第29-36页 |
| 1.兔椎间盘纤维环细胞的培养 | 第29-30页 |
| 2.ABC免疫组织化学鉴定兔椎间盘纤维环细胞 | 第30-31页 |
| 3.rAAV-EGFP转染兔纤维环细胞 | 第31页 |
| 4.rAAV-hVEGF_(165)转染兔纤维环细胞及hVEGF_(165)表达的Western lotting鉴定 | 第31-33页 |
| ·rAAV-hVEGF_(165)转染兔纤维环细胞 | 第31-32页 |
| ·hVEGF_(165)表达的Western blotting鉴定 | 第32-33页 |
| 5.rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及TGFβ1表达的Western blotting鉴定 | 第33-34页 |
| ·rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞 | 第33-34页 |
| ·TGFβ1蛋白表达的Western blotting鉴定 | 第34页 |
| 6.rAAV-hVEGF_(165)、rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及其Ⅰ型胶原表达量的Western blotting检测 | 第34-36页 |
| ·rAAV-hVEGF_(165)、rAAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞 | 第34页 |
| ·纤维环细胞胶原蛋白的的Western blotting检测 | 第34-36页 |
| 结果 | 第36-40页 |
| ·兔椎间盘纤维环细胞的培养 | 第36页 |
| ·ABC免疫组织化学鉴定兔椎间盘纤维环细胞 | 第36-37页 |
| ·rAAV-EGFP转染兔纤维环细胞 | 第37页 |
| ·rAAV-hVEGF_(165)转染兔纤维环细胞及hVEGF_(165)表达的Western blotting鉴定 | 第37-38页 |
| ·rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及TGFβ1表达的Western blotting鉴定 | 第38-39页 |
| ·rAAV-hVEGF_(165)、rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及其Ⅰ型胶表达量的Western blotting检测 | 第39-40页 |
| 讨论 | 第40-46页 |
| 小结 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-50页 |
| 综述 | 第50-60页 |
| 综述参考文献 | 第60-64页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第64-65页 |
| 附录 | 第65-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 版权声明 | 第76-77页 |
