| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-26页 |
| 前言 | 第26-29页 |
| 第一部分 miR-126表达异常与自身免疫关系的研究 | 第29-90页 |
| 第一节 miR-126靶基因预测及验证 | 第29-44页 |
| 前言 | 第29页 |
| 材料和方法 | 第29-39页 |
| 1. 细胞 | 第29页 |
| 2. 仪器设备与试剂 | 第29-33页 |
| ·主要实验仪器 | 第30-31页 |
| ·主要试剂 | 第31-32页 |
| ·质粒准备 | 第32页 |
| ·基因克隆所用溶液 | 第32-33页 |
| 3. 实验方法 | 第33-39页 |
| ·细胞基因组DNA的抽提 | 第33-34页 |
| ·质粒重组、转化、抽提与鉴定 | 第34-39页 |
| ·制备感受态细胞 | 第34-35页 |
| ·pMIR-REPORT luciferase miRNA expression reporter vector提取 | 第35页 |
| ·克隆DNMT1基因3'-UTR区域 | 第35-37页 |
| ·质粒酶切、纯化和重组 | 第37-38页 |
| ·质粒转化 | 第38页 |
| ·质粒鉴定与抽提、纯化 | 第38-39页 |
| ·重组质粒测序 | 第39页 |
| ·分析测序结果 | 第39页 |
| ·细胞转染及荧光素酶报告基因活性分析 | 第39页 |
| 结果 | 第39-44页 |
| 1. 证实DNMT1是miR-126的直接靶基因 | 第39-44页 |
| ·构建DNMT1报告基因表达载体 | 第39-42页 |
| ·荧光素酶活性分析 | 第42-44页 |
| 第二节 miR-126过表达诱导自身免疫反应 | 第44-74页 |
| 前言 | 第44页 |
| 材料和方法 | 第44-66页 |
| 1. 研究对象 | 第44页 |
| 2. 仪器设备与试剂 | 第44-51页 |
| ·主要实验仪器 | 第45-46页 |
| ·主要试剂与耗材 | 第46-48页 |
| ·其他常用试剂 | 第48页 |
| ·常用试剂配制 | 第48页 |
| ·Western blotting所用溶液 | 第48-50页 |
| ·储存液 | 第48-49页 |
| ·工作液 | 第49-50页 |
| ·基因克隆所用溶液 | 第50页 |
| ·Real-time PCR引物 | 第50页 |
| ·质粒准备 | 第50-51页 |
| 3. 实验方法 | 第51-66页 |
| ·外周血单个核细胞的分离及免疫磁珠进一步分离外周血CD4~+T和B细胞 | 第51-52页 |
| ·外周血单个核细胞及CD4~+T细胞的分离 | 第51页 |
| ·免疫磁珠进一步分离外周血CD4~+T细胞 | 第51-52页 |
| ·免疫磁珠分离B细胞 | 第52页 |
| ·转染 | 第52-53页 |
| ·流式细胞仪检测 | 第53页 |
| ·RNA提取和real-time PCR | 第53-55页 |
| ·RNA提取 | 第53-54页 |
| ·实时-定量PCR | 第54-55页 |
| ·蛋白抽提和定量 | 第55-56页 |
| ·蛋白抽提 | 第55页 |
| ·蛋白定量 | 第55-56页 |
| ·Western Blotting实验步骤 | 第56-58页 |
| ·DNA提取和亚硫酸氢钠测序 | 第58-65页 |
| ·DNA抽提 | 第58页 |
| ·亚硫酸氢钠测序 | 第58-65页 |
| ·自身B细胞孵育和IgG抗体检测 | 第65-66页 |
| ·CD4~+T细胞与自身B细胞孵育 | 第65页 |
| ·IgG抗体检测 | 第65-66页 |
| ·统计学方法 | 第66页 |
| 结果 | 第66-74页 |
| 1. 转染对照质粒组和miR-126表达质粒组CD4~+T细胞miR-126,DNMT1,CD11a,CD70 mRNA的表达水平 | 第66-67页 |
| 2. 转染对照质粒组和miR-126表达质粒组CD4~+T细胞DNMT1的蛋白表达水平 | 第67-68页 |
| 3. 转染对照质粒组和miR-126表达质粒组CD4~+T细胞CD11a和CD70的蛋白表达水平 | 第68-70页 |
| 4. 转染对照质粒组和miR-126表达质粒组CD4~+T细胞刺激自身B细胞产生IgG水平 | 第70页 |
| 5. 转染对照质粒组和miR-126表达质粒组CD4~+T细胞CD70(TNFSF7)基因和CD11a(ITGAL)基因启动子序列甲基化状态 | 第70-74页 |
| 第三节 下调miR-126表达抑制自身免疫反应 | 第74-90页 |
| 前言 | 第74页 |
| 材料和方法 | 第74-79页 |
| 1. 研究对象 | 第74页 |
| 2. 仪器设备与试剂 | 第74-78页 |
| ·主要实验仪器 | 第75-76页 |
| ·主要试剂与耗材 | 第76-78页 |
| ·Real-time PCR引物 | 第78页 |
| ·miR-126 inhibitor的合成 | 第78页 |
| 3. 实验方法 | 第78-79页 |
| ·外周血单个核细胞的分离及免疫磁珠进一步分离外周血CD4~+T、B细胞 | 第78页 |
| ·转染 | 第78页 |
| ·RNA提取和Real-time PCR | 第78页 |
| ·RNA提取 | 第78页 |
| ·Real-time PCR | 第78页 |
| ·流式细胞仪检测 | 第78页 |
| ·DNA提取及亚硫酸氢钠测序 | 第78页 |
| ·蛋白提取、定量及Western blotting | 第78页 |
| ·自身B细胞孵育和IgG抗体产量检测 | 第78页 |
| ·统计学方法 | 第78-79页 |
| 结果 | 第79-86页 |
| 1. 转染对照Scrambled组和miR-126 inhibitor组SLE患者CD4~+T细胞miR-126,DNMT1,CD11a,CD70 mRNA的表达水平 | 第79-80页 |
| 2. 转染对照Scrambled组和miR-126 inhibitor组SLE患者CD4~+T细胞DNMT1蛋白表达水平 | 第80-81页 |
| 3. 转染对照Scrambled组和miR-126 inhibitor组SLE患者CD4~+T细胞CD11a、CD70蛋白表达水平 | 第81-83页 |
| 4. 转染对照Scrambled组和miR-126 inhibitor组SLE患者CD4~+T细胞刺激自身B细胞产生IgG水平 | 第83-84页 |
| 5. 转染对照Scrambled组和miR-126 inhibitor组SLE患者CD4~+T细胞CD70基因(TNFSF7)和CD11a基因(ITGAL)启动子序列甲基化状态 | 第84-86页 |
| 讨论 | 第86-90页 |
| 第二部分 SLE CD4~+T细胞miR-126宿主基因EGFL7调控miR-126表达 | 第90-103页 |
| 前言 | 第90页 |
| 材料和方法 | 第90-95页 |
| 1. 研究对象 | 第90-91页 |
| 2. 仪器设备与试剂 | 第91-93页 |
| ·主要实验仪器 | 第91-92页 |
| ·主要试剂与耗材 | 第92-93页 |
| ·其他常用试剂 | 第93页 |
| ·常用试剂配制 | 第93页 |
| ·基因克隆所用溶液 | 第93页 |
| 3 实验方法 | 第93-94页 |
| ·外周血单个核细胞的分离及免疫磁珠进一步分离外周血CD4~+T细胞 | 第93页 |
| ·RNA抽提和实时定量RT-PCR | 第93-94页 |
| ·DNA提取和亚硫酸氢钠测序 | 第94页 |
| 4 统计学分析 | 第94-95页 |
| 结果 | 第95-100页 |
| 1. SLE患者外周血CD4~+T细胞EGFL7mRNA表达水平 | 第95页 |
| 2. SLE患者外周血CD4~+T细胞EGFL7mRNA表达水平与miR-126mRNA表达水平的相关性分析 | 第95-96页 |
| 3. EGFL7基因启动子调节序列甲基化水平 | 第96-100页 |
| 讨论 | 第100-102页 |
| 结论 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-111页 |
| 综述 | 第111-127页 |
| 致谢 | 第127-129页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及研究成果 | 第129-130页 |
