| 摘要 | 第5-8页 |
| ABSTRACT | 第8-11页 |
| 前言 | 第19-21页 |
| 技术路线图 | 第21-22页 |
| 第一部分 血清CML水平与冠状动脉粥样硬化斑块内钙化的关系研究 | 第22-28页 |
| 1 研究内容与方法 | 第22-24页 |
| 1.1 研究对象 | 第22页 |
| 1.2 纳入标准与排除标准 | 第22-23页 |
| 1.2.1 纳入标准 | 第22页 |
| 1.2.2 排除标准 | 第22-23页 |
| 1.3 CCTA检查前准备 | 第23页 |
| 1.4 设备和方法 | 第23页 |
| 1.5 图像分析 | 第23-24页 |
| 1.6 统计学方法 | 第24页 |
| 2 结果 | 第24-26页 |
| 2.1 一般资料 | 第24-25页 |
| 2.2 冠状动脉钙化情况 | 第25-26页 |
| 2.3 血清CML水平与冠状动脉粥样硬化斑块钙化积分的相关性分析 | 第26页 |
| 3 讨论 | 第26-28页 |
| 第二部分 自噬在RAGE/Gal3介导CML调控大鼠平滑肌细胞钙化转归中的作用 | 第28-55页 |
| 1 实验材料 | 第28-32页 |
| 1.1 实验细胞株、大肠杆菌 | 第28页 |
| 1.2 试剂及配制 | 第28-30页 |
| 1.3 主要仪器 | 第30-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.1 细胞培养及分组 | 第32-34页 |
| 2.1.1 细胞复苏与培养 | 第32页 |
| 2.1.2 细胞计数 | 第32页 |
| 2.1.3 细胞传代 | 第32-33页 |
| 2.1.4 细胞冻存 | 第33页 |
| 2.1.5 实验分组 | 第33-34页 |
| 2.2 RAGE、Gal3沉默细胞株的构建及筛选 | 第34-37页 |
| 2.2.1 设计RAGE、Gal3的sh RNA序列 | 第34-35页 |
| 2.2.2 RAGE、Gal3 sh RNA慢病毒表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 2.2.3 质粒的扩增、抽提 | 第36页 |
| 2.2.4 利用 293T包装慢病毒 | 第36-37页 |
| 2.2.5 慢病毒感染A7r5细胞及稳转株筛选 | 第37页 |
| 2.2.6 A7r5细胞RAGE、Gal3沉默细胞株的鉴定 | 第37页 |
| 2.3 细胞实时定量PCR检测（RT-PCR） | 第37-39页 |
| 2.3.1 细胞内总RNA的提取 | 第37-38页 |
| 2.3.2 借助核酸测定仪检测细胞RNA的浓度、纯度 | 第38页 |
| 2.3.3 逆转录为c DNA | 第38-39页 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR扩增RAGE、Gal3、GAPDH | 第39页 |
| 2.3.5 实时荧光定量PCR数据分析 | 第39页 |
| 2.4 细胞茜素红染色 | 第39-40页 |
| 2.5 细胞钙含量测定 | 第40页 |
| 2.6 自噬双标Ad-m RFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞 | 第40页 |
| 2.7 细胞内总蛋白的提取及Western蛋白免疫印迹 | 第40-43页 |
| 2.7.1 细胞内总蛋白的提取 | 第40-41页 |
| 2.7.2 BCA法检测细胞内总蛋白浓度 | 第41页 |
| 2.7.3 SDS-PAGE凝胶的灌制 | 第41-42页 |
| 2.7.4 上样及电泳 | 第42页 |
| 2.7.5 转膜 | 第42页 |
| 2.7.6 封闭、抗体孵育及曝光 | 第42-43页 |
| 3 统计学处理 | 第43页 |
| 4 结果 | 第43-51页 |
| 4.1 感染RAGE、Gal3 sh RNA序列后，A7r5细胞RAGE、Gal3的表达 | 第43-44页 |
| 4.2 CML促进VSMCs钙化 | 第44-45页 |
| 4.3 CML促进VSMCs Runx2、LC3表达 | 第45页 |
| 4.4 沉默RAGE促进VSMCs大钙化，沉默Gal3促进VMSC微钙化 | 第45-46页 |
| 4.5 沉默RAGE、Gal3缓解CML诱导的自噬流受阻 | 第46-47页 |
| 4.6 沉默RAGE、Gal3后VSMCs RAGE、Gal3、TRAP、TNAP、LC3、p62的表达 | 第47-48页 |
| 4.7 抑制自噬增加VSMCs钙化 | 第48-49页 |
| 4.8 沉默RAGE、Gal3联合抑制自噬后VSMCs RAGE、Gal3、TRAP、TNAP、LC3、p62的表达 | 第49-51页 |
| 5 讨论 | 第51-55页 |
| 第三部分 自噬在RAGE/Gal3介导CML调控糖尿病动脉粥样硬化斑块内钙化转归中的作用 | 第55-78页 |
| 1 实验材料 | 第55-58页 |
| 1.1 实验细胞株、大肠杆菌 | 第55页 |
| 1.2 动物及饲料 | 第55页 |
| 1.3 试剂及配制 | 第55-57页 |
| 1.4 主要仪器 | 第57-58页 |
| 2 实验方法 | 第58-67页 |
| 2.1 借助改良型组织贴块法获取、培养、鉴定原代小鼠主动脉VSMCs ..402.1.1 获取、培养原代小鼠主动脉VSMCs | 第58-59页 |
| 2.1.1 获取、培养原代小鼠主动脉 VSMCs | 第58-59页 |
| 2.1.2 鉴定原代小鼠主动脉VSMCs | 第59页 |
| 2.2 RAGE、Gal3沉默腺相关病毒表达载体的构建及筛选 | 第59-62页 |
| 2.2.1 设计RAGE、Gal3的sh RNA序列 | 第59-60页 |
| 2.2.2 RAGE、Gal3 sh RNA腺病毒表达载体的构建 | 第60页 |
| 2.2.3 质粒的扩增、抽提 | 第60页 |
| 2.2.4 利用 293A包装腺病毒 | 第60-61页 |
| 2.2.5 腺病毒感染原代小鼠主动脉VSMCs | 第61页 |
| 2.2.6 原代小鼠主动脉VSMCs RAGE、Gal3沉默细胞株的鉴定 | 第61页 |
| 2.2.7 RAGE、Gal3腺相关病毒表达载体的构建 | 第61页 |
| 2.2.8 质粒的扩增、抽提 | 第61页 |
| 2.2.9 利用AAV-293 包装腺相关病毒 | 第61-62页 |
| 2.2.10 经尾静脉注射腺相关病毒感染小鼠 | 第62页 |
| 2.3 细胞实时定量PCR检测（RT-PCR） | 第62页 |
| 2.4 实验动物及分组 | 第62-63页 |
| 2.5 ApoE~(-/-)小鼠血脂、血糖、血清CML检测 | 第63页 |
| 2.6 病理标本的留取 | 第63-64页 |
| 2.7 石蜡切片的制备过程 | 第64页 |
| 2.8 石蜡切片的脱蜡、水化过程 | 第64页 |
| 2.9 苏木素-伊红染色（HE染色） | 第64-65页 |
| 2.10 Von Kossa染色 | 第65页 |
| 2.11 Masson染色 | 第65页 |
| 2.12 TRAP染色 | 第65-66页 |
| 2.13 组织钙含量测定 | 第66页 |
| 2.14 免疫组织化学染色 | 第66-67页 |
| 2.15 主动脉内总蛋白的提取及Western蛋白免疫印迹 | 第67页 |
| 2.15.1 主动脉内总蛋白的提取 | 第67页 |
| 2.15.2 BCA法检测主动脉内总蛋白浓度及Western蛋白免疫印迹 | 第67页 |
| 3 统计学处理 | 第67页 |
| 4 结果 | 第67-76页 |
| 4.1 原代小鼠主动脉VSMCs的培养与鉴定 | 第67-68页 |
| 4.1.1 原代小鼠主动脉VSMCs的培养 | 第67-68页 |
| 4.1.2 原代小鼠主动脉VSMCs的免疫荧光鉴定 | 第68页 |
| 4.2 感染RAGE、Gal3 sh RNA序列后，原代小鼠主动脉VSMCs中RAGE、Gal3的表达 | 第68-69页 |
| 4.3 ApoE~(-/-)小鼠血清学的变化 | 第69-70页 |
| 4.4 CML促进ApoE~(-/-)小鼠主动脉斑块内钙化 | 第70-71页 |
| 4.5 CML促进ApoE~(-/-)小鼠主动脉Runx2、LC3表达 | 第71-72页 |
| 4.6 沉默RAGE促进斑块大钙化，沉默Gal3促进斑块微钙化，激动自噬减少斑块钙化 | 第72-73页 |
| 4.7 沉默RAGE、Gal3联合激动自噬后ApoE~(-/-)小鼠主动脉斑块RAGE、Gal3、TRAP、TNAP的表达 | 第73-75页 |
| 4.8 沉默RAGE、Gal3联合激动自噬后ApoE~(-/-)小鼠主动脉斑块LC3B、p62的表达 | 第75-76页 |
| 5 讨论 | 第76-78页 |
| 第四部分 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第85-87页 |
| 硕士期间参加的学术交流 | 第87页 |
