| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-16页 |
| 英文缩写词表 | 第16-18页 |
| 引言 | 第18-20页 |
| 第1章 IFN-γ 的研究进展 | 第20-34页 |
| 1 IFN-γ 的基本概况 | 第20页 |
| 2 IFN-γ 的产生 | 第20-21页 |
| 3 IFN-γ 受体 | 第21-22页 |
| 4 IFN-γ 的信号传导 | 第22-25页 |
| ·Stat1 | 第22-24页 |
| ·IRF（IFN 调控因子） | 第24页 |
| ·IFN-γ信号传导的负调控 | 第24-25页 |
| 5 IFN-γ 的生物学活性及其机制 | 第25-29页 |
| ·IFN-γ诱导的抗病毒状态 | 第25-26页 |
| ·IFN-γ的免疫调节作用 | 第26-29页 |
| ·对Ⅰ类抗原提呈途径的作用 | 第26-27页 |
| ·对Ⅱ类抗原提呈途径的作用 | 第27页 |
| ·抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡 | 第27页 |
| ·IFN-γ 对巨噬细胞的作用 | 第27-29页 |
| ·对免疫应答的调节 | 第29页 |
| ·炎性反应 | 第29页 |
| ·抗肿瘤作用 | 第29页 |
| 6 IFN-γ 的应用研究进展 | 第29-34页 |
| ·人 IFN-γ 的应用研究进展 | 第29-31页 |
| ·动物IFN-γ的应用研究进展 | 第31-34页 |
| 第2章 poIFN-γ 的原核表达及抗血清的制备 | 第34-52页 |
| 1 材料与方法 | 第34-44页 |
| ·材料 | 第34-38页 |
| ·菌株与质粒 | 第34页 |
| ·试剂和酶 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| ·主要溶液 | 第35-37页 |
| ·实验动物 | 第37页 |
| ·引物设计 | 第37-38页 |
| ·方法 | 第38-44页 |
| ·PCR 扩增poIFN-γ成熟多肽基因 | 第38页 |
| ·PCR 产物及pET-28a(+)载体的双酶切 | 第38-39页 |
| ·双酶切产物的回收 | 第39页 |
| ·poIFN-γ与pET-28a(+)相连 | 第39页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态的制备 | 第39-40页 |
| ·连接产物的转化 | 第40页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-poIFN-γ的提取及酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·pET-28a(+)-poIFN-γ质粒的大量制备（碱裂解法） | 第41页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-poIFN-γ转化表达菌BL21(λDE3) | 第41页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-poIFN-γ的诱导表达 | 第41-42页 |
| ·包涵体分离、洗涤及溶解 | 第42页 |
| ·包涵体的透析复性 | 第42页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第42-43页 |
| ·小鼠多克隆血清的制备 | 第43页 |
| ·抗血清效价的测定 | 第43-44页 |
| 2 结果 | 第44-48页 |
| ·poIFNγ基因扩增 | 第44页 |
| ·重组原核表达质粒的鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组原核表达质粒pET-28a(+)-poIFN-γ的核苷酸序列测定 | 第45-46页 |
| ·原核表达产物的鉴定 | 第46-47页 |
| ·包涵体透析复性 | 第47-48页 |
| ·复性蛋白浓度的测定 | 第48页 |
| ·抗血清效价的检测 | 第48页 |
| 3 讨论 | 第48-50页 |
| 4 小结 | 第50-52页 |
| 第3章 P.pastoris 分泌表达 poIFN-γ 系统的建立 | 第52-74页 |
| 1 材料与方法 | 第52-65页 |
| ·材料 | 第52-55页 |
| ·菌株与质粒 | 第52页 |
| ·试剂和酶 | 第52页 |
| ·主要仪器 | 第52-53页 |
| ·主要溶液 | 第53-54页 |
| ·引物设计 | 第54-55页 |
| ·方法 | 第55-65页 |
| ·PUC18 质粒及pPIC9K 质粒的双酶切 | 第55页 |
| ·双酶切产物的回收 | 第55页 |
| ·α因子与PUC18 相连 | 第55-56页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态的制备 | 第56页 |
| ·连接产物的转化 | 第56页 |
| ·重组质粒（PUC18-α因子）的提取及酶切鉴定 | 第56-57页 |
| ·PCR 扩增poIFN-γ成熟多肽基因 | 第57页 |
| ·分别以XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切PUC18-α与扩增的poIFN-γ | 第57-58页 |
| ·双酶切产物的回收 | 第58页 |
| ·poIFN-γ与PUC18-α因子相连 | 第58页 |
| ·连接产物的转化 | 第58页 |
| ·重组质粒PUC18-α-poIFN-γ的提取及酶切鉴定 | 第58-59页 |
| ·别以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切PUC18-α-poIFN-γ及pPIC9K | 第59-60页 |
| ·以酶切产物的回收与连接 | 第60页 |
| ·连接产物的转化 | 第60页 |
| ·重组质粒pPIC9K -α-poIFN-γ的提取、酶切鉴定及测序 | 第60-62页 |
| ·重组质粒pPIC9K -α-poIFN-γ的线性化 | 第62页 |
| ·P.pastoris GS115 感受态的制备 | 第62页 |
| ·线性化质粒电转 P.pastoris GS115 | 第62-63页 |
| ·筛选遗传霉素抗性转化子 | 第63页 |
| ·重组子的 PCR 鉴定 | 第63-64页 |
| ·Mut+重组子的诱导表达 | 第64-65页 |
| 2 结果 | 第65-70页 |
| ·poIFN-γ成熟多肽基因的PCR 扩增 | 第65-66页 |
| ·重组质粒PUC18-α- poIFN-γ的双酶切鉴定 | 第66页 |
| ·重组质粒pPIC9K - poIFN-γ的酶切鉴定 | 第66-68页 |
| ·重组子的 PCR 鉴定 | 第68-69页 |
| ·His+重组子的诱导表达 | 第69-70页 |
| ·重组质粒 pPIC9K - poIFN-γ 的 DNA 测序鉴定 | 第70页 |
| 3 讨论 | 第70-72页 |
| 4 小结 | 第72-74页 |
| 第4章 poIFN-γ 在 P.pastoris 中的分泌表达及大规模发酵条件的研究 | 第74-89页 |
| 1 材料与方法 | 第74-79页 |
| ·材料 | 第74-76页 |
| ·菌种 | 第74页 |
| ·主要试剂 | 第74页 |
| ·主要仪器 | 第74-75页 |
| ·主要培养基和溶液 | 第75-76页 |
| ·方法 | 第76-79页 |
| ·摇瓶培养优化发酵条件 | 第76-77页 |
| ·种子的培养准备 | 第76页 |
| ·确定摇瓶培养的最佳诱导时间 | 第76-77页 |
| ·诱导阶段不同pH 值对poIFN-γ表达的影响 | 第77页 |
| ·不同初始甘油浓度对工程菌生长的影响 | 第77页 |
| ·不同甲醇浓度对工程菌生长的影响 | 第77页 |
| ·小规模发酵 | 第77-78页 |
| ·工程菌的发酵 | 第77-78页 |
| ·工程菌生长曲线的绘制 | 第78页 |
| ·大规模发酵 | 第78-79页 |
| ·一级接种 | 第78页 |
| ·二级接种 | 第78页 |
| ·上罐准备 | 第78页 |
| ·发酵-甘油批式阶段 | 第78页 |
| ·发酵-甘油补料阶段 | 第78-79页 |
| ·发酵-甲醇诱导阶段 | 第79页 |
| ·目的蛋白分析 | 第79页 |
| 2 结果 | 第79-85页 |
| ·摇瓶培养条件下对工程菌表达条件的优化 | 第79-82页 |
| ·诱导时间对目的蛋白表达的影响 | 第79-80页 |
| ·诱导期间不同pH 值对目的蛋白表达的影响 | 第80-81页 |
| ·初始培养基中甘油浓度对菌体生长的影响 | 第81-82页 |
| ·P.pastoris 工程菌的生长曲线 | 第82-83页 |
| ·不同发酵时间对目的蛋白表达的影响 | 第83-84页 |
| ·P.pastoris 工程菌大规模发酵的结果 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-88页 |
| 4 小结 | 第88-89页 |
| ·摇瓶培养条件下，确定了P.pastoris 工程菌的最佳诱导时间为72h | 第88页 |
| ·逐步扩大培养规模，根据摇瓶条件下摸索的最佳条件 | 第88页 |
| ·进一步扩大培养规模，在50L 发酵罐中以优化的条件对P.pastoris 工程菌进行大规模发酵得到了较高产量的目的蛋白，浓度为400mg/L | 第88-89页 |
| 第5章 poIFN-γ 的纯化及免疫学、生物学活性检测 | 第89-103页 |
| 1 材料与方法 | 第89-94页 |
| ·材料 | 第89-91页 |
| ·细胞和病毒 | 第89页 |
| ·主要仪器 | 第89页 |
| ·主要试剂和溶液 | 第89-91页 |
| ·方法 | 第91-94页 |
| ·poIFN-γ蛋白的纯化 | 第91页 |
| ·poIFN-γ蛋白的浓缩 | 第91页 |
| ·poIFN-γ蛋白的纯化 | 第91页 |
| ·Lowry 法测蛋白的浓度 | 第91-92页 |
| ·间接ELISA 检测poIFN-γ与抗体结合活性的检测 | 第92页 |
| ·Western-blot 检测 | 第92页 |
| ·重组poIFN-γ生物活性的测定 | 第92-94页 |
| ·重组poIFN-γ抗HCV 的活性测定 | 第92-93页 |
| ·细胞病变抑制法测定重组poIFN-γ抗PRV 的活性测定 | 第93-94页 |
| 2 结果 | 第94-98页 |
| ·疏水色谱 | 第94-95页 |
| ·离子交换层析 | 第95-96页 |
| ·Lowry 法测蛋白的浓度 | 第96页 |
| ·间接ELISA 检测poIFN-γ与抗体结合活性的检测 | 第96页 |
| ·Western blot 检测 | 第96-97页 |
| ·重组poIFN-γ生物学活性的测定 | 第97-98页 |
| ·poIFN-γ抗HCV 的活性 | 第97-98页 |
| ·细胞病变抑制法测定poIFN-γ抗PRV 的活性 | 第98页 |
| 3 讨论 | 第98-101页 |
| 4 小结 | 第101-103页 |
| 结论 | 第103-105页 |
| 参考文献 | 第105-117页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第117-119页 |
| 致谢 | 第119页 |
