| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第15-16页 |
| 1 文献综述 | 第16-27页 |
| 1.1 前言 | 第16页 |
| 1.2 单增李斯特菌中的自溶素 | 第16-18页 |
| 1.3 自溶素的结构 | 第18-21页 |
| 1.3.1 信号肽序列 | 第19页 |
| 1.3.2 肽聚糖水解酶域 | 第19-20页 |
| 1.3.3 细胞壁锚定域 | 第20-21页 |
| 1.4 自溶素在细菌致病过程中的作用 | 第21-23页 |
| 1.4.1 参与细胞粘附与侵袭 | 第21页 |
| 1.4.2 参与细菌生存与繁殖 | 第21-22页 |
| 1.4.3 诱导炎症反应 | 第22-23页 |
| 1.4.4 参与细菌毒力 | 第23页 |
| 1.5 自溶素的调控机制 | 第23-25页 |
| 1.5.1 转录水平调控 | 第23-24页 |
| 1.5.2 自我抑制 | 第24页 |
| 1.5.3 肽聚糖结构修饰 | 第24页 |
| 1.5.4 pH调控 | 第24-25页 |
| 1.6 选题依据及研究内容 | 第25页 |
| 1.7 研究目的及意义 | 第25-27页 |
| 2 单核细胞增生性李斯特菌lmo1521基因的表达及产物纯化 | 第27-33页 |
| 2.1 实验材料、主要试剂、试剂配制和仪器设备 | 第27-28页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第27页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.3 试剂配制 | 第28页 |
| 2.1.4 仪器设备 | 第28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-29页 |
| 2.2.1 lmo1521基因的原核表达 | 第28页 |
| 2.2.2 SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白 | 第28-29页 |
| 2.2.3 表达蛋白的可溶性分析 | 第29页 |
| 2.2.4 Ni-NTA树脂纯化表达蛋白 | 第29页 |
| 2.2.5 Ni-NTA树脂的再生 | 第29页 |
| 2.3 结果与分析 | 第29-33页 |
| 2.3.1 lmo1521基因表达产物Lmo1521蛋白 | 第29-30页 |
| 2.3.2 Lmo1521蛋白为可溶性蛋白 | 第30-31页 |
| 2.3.3 Ni-NTA亲和纯化获得高纯度Lmo1521蛋白 | 第31-33页 |
| 3 Lmo1521蛋白细胞壁水解酶活性分析 | 第33-47页 |
| 3.1 实验材料、主要试剂、试剂配制和仪器设备 | 第33-34页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第33页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第33-34页 |
| 3.1.3 试剂配制 | 第34页 |
| 3.1.4 仪器设备 | 第34页 |
| 3.2 实验方法 | 第34-36页 |
| 3.2.1 单核细胞增生性李斯特菌和大肠杆菌细胞壁的制备 | 第34页 |
| 3.2.2 复性SDS-PAGE电泳分析Lmo1521细胞壁水解酶活性 | 第34-35页 |
| 3.2.3 革兰氏染色观察Lmo1521蛋白对单增李斯特菌活细胞的破坏作用 | 第35页 |
| 3.2.4 过表达的Lmo1521蛋白对宿主菌生长的影响 | 第35页 |
| 3.2.5 Lmo1521蛋白对不同底物降解活性的研究 | 第35-36页 |
| 3.2.6 Lmo1521蛋白最适水解pH值的研究 | 第36页 |
| 3.3 结果与分析 | 第36-41页 |
| 3.3.1 复性SDS-PAGE电泳证明Lmo1521蛋白具有水解自身细胞壁的活性 | 第36-37页 |
| 3.3.2 Lmo1521蛋白能够破坏单增李斯特菌活细胞 | 第37-39页 |
| 3.3.3 过表达的Lmo1521蛋白抑制宿主菌的生长 | 第39-40页 |
| 3.3.4 Lmo1521蛋白水解不同的细胞壁底物 | 第40页 |
| 3.3.5 Lmo1521蛋白最适水解pH值为中碱性 | 第40-41页 |
| 3.4 讨论 | 第41-47页 |
| 4 构建pMAD△lmo1521重组质粒 | 第47-57页 |
| 4.1 实验材料、主要试剂和仪器设备 | 第47-48页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第47页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第47页 |
| 4.1.3 构建pMAD△lmo1521重组质粒所用的特异性PCR引物 | 第47-48页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第48页 |
| 4.2 实验方法 | 第48-54页 |
| 4.2.1 提取单核细胞增生性李斯特菌基因组DNA | 第48页 |
| 4.2.2 提取pET-28a(+)质粒DNA | 第48页 |
| 4.2.3 提取pMAD质粒DNA | 第48-49页 |
| 4.2.4 PCR扩增lmo1520、kanamycin及lmo1522基因 | 第49-50页 |
| 4.2.5 SOE-PCR拼接lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段 | 第50-51页 |
| 4.2.6 插入片段及连接载体的制备 | 第51-52页 |
| 4.2.7 pMAD质粒与lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段的连接 | 第52页 |
| 4.2.8 pMAD△lmo1521重组质粒的转化 | 第52-53页 |
| 4.2.9 菌落PCR及双酶切验证pMAD△lmo1521重组质粒 | 第53-54页 |
| 4.3 结果与分析 | 第54-57页 |
| 4.3.1 SOE-PCR产物:lmo1520-kanamycin-lmo1522基因片段 | 第54页 |
| 4.3.2 菌落PCR验证检测pMAD△lmo1521重组质粒 | 第54-55页 |
| 4.3.3 pMAD△lmo1521重组质粒的双酶切验证 | 第55-57页 |
| 5 总结与展望 | 第57-59页 |
| 5.1 总结 | 第57页 |
| 5.2 论文创新点 | 第57-58页 |
| 5.3 课题展望 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 附录 | 第63-66页 |
| 作者简介 | 第66页 |
