| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 无乳链球菌概述 | 第13页 |
| 1.2 无乳链球菌的危害 | 第13页 |
| 1.3 无乳链球菌的诊断方法 | 第13-15页 |
| 1.3.1 PCR | 第13-14页 |
| 1.3.2 LAMP | 第14页 |
| 1.3.3 生化试验 | 第14页 |
| 1.3.4 荧光原位杂交(FISH) | 第14-15页 |
| 1.4 无乳链球菌表面蛋白 | 第15-18页 |
| 1.4.1 C抗原 | 第15页 |
| 1.4.2 Alp蛋白家族 | 第15-16页 |
| 1.4.3 β蛋白 | 第16-17页 |
| 1.4.4 HvgA | 第17页 |
| 1.4.5 富含丝氨酸重复蛋白(SRR) | 第17页 |
| 1.4.6 Sip蛋白 | 第17页 |
| 1.4.7 Spb1蛋白 | 第17-18页 |
| 1.5 链球菌毒力因子 | 第18-19页 |
| 1.5.1 CpsY和CpsD | 第18页 |
| 1.5.2 M-like protein | 第18页 |
| 1.5.3 C5a肽酶 | 第18-19页 |
| 1.5.4 其它毒力因子 | 第19页 |
| 1.6 罗非鱼自身抗性与免疫治疗 | 第19-20页 |
| 1.7 链球菌单克隆抗体的研究现状 | 第20-21页 |
| 1.8 本研究的目的意义 | 第21-22页 |
| 第二章 罗非鱼无乳链球菌的分离纯化鉴定及保存 | 第22-30页 |
| 2.1 材料与方法 | 第22-23页 |
| 2.1.1 病料 | 第22页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.3 培养基及常用溶液配制 | 第23页 |
| 2.1.4 仪器和设备 | 第23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-25页 |
| 2.2.1 病原菌分离培养 | 第23-24页 |
| 2.2.2 形态特征鉴定 | 第24页 |
| 2.2.3 生理生化特性鉴定 | 第24页 |
| 2.2.4 PCR鉴定 | 第24-25页 |
| 2.2.5 动物回归试验 | 第25页 |
| 2.3 结果 | 第25-28页 |
| 2.3.1 病原菌分离培养 | 第25页 |
| 2.3.2 形态特征鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.3 生理生化特性鉴定 | 第26-27页 |
| 2.3.4 PCR鉴定 | 第27-28页 |
| 2.3.5 动物回归试验结果 | 第28页 |
| 2.4 讨论 | 第28-30页 |
| 第三章 抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体的制备 | 第30-47页 |
| 3.1 材料 | 第30-34页 |
| 3.1.1 实验动物及细胞株 | 第30页 |
| 3.1.2 细菌来源 | 第30-31页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第31页 |
| 3.1.4 仪器设备及耗材 | 第31-32页 |
| 3.1.5 试剂配制 | 第32-34页 |
| 3.2 实验方法 | 第34-39页 |
| 3.2.1 罗非鱼无乳链球菌全菌抗原的制备 | 第34页 |
| 3.2.2 抗原浓度的测定(麦氏比浊法) | 第34页 |
| 3.2.3 动物免疫 | 第34页 |
| 3.2.4 间接ELISA方法的建立 | 第34-35页 |
| 3.2.5 小鼠血清效价测定 | 第35-36页 |
| 3.2.6 细胞融合 | 第36-37页 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第37页 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 | 第37-38页 |
| 3.2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第38页 |
| 3.2.10 单克隆抗体的制备 | 第38-39页 |
| 3.3 结果 | 第39-45页 |
| 3.3.1 间接ELISA方法的建立 | 第39-40页 |
| 3.3.2 免疫小鼠血清效价的测定结果 | 第40-41页 |
| 3.3.3 细胞融合 | 第41-45页 |
| 3.4 讨论 | 第45-47页 |
| 3.4.1 抗原的选择 | 第45页 |
| 3.4.2 动物免疫 | 第45页 |
| 3.4.3 间接ELISA方法的建立 | 第45-46页 |
| 3.4.4 细胞融合 | 第46-47页 |
| 第四章 抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体生物学特性的鉴定 | 第47-55页 |
| 4.1 材料 | 第47页 |
| 4.1.1 主要试剂 | 第47页 |
| 4.1.2 试验用试剂配制 | 第47页 |
| 4.1.3 主要仪器设备及耗材 | 第47页 |
| 4.2 方法 | 第47-49页 |
| 4.2.1 单抗杂交瘤细胞培养上清及部分杂交瘤株小鼠腹水效价的测定 | 第47-48页 |
| 4.2.2 单抗杂交瘤细胞的染色体分析 | 第48页 |
| 4.2.3 单抗亚类的鉴定 | 第48页 |
| 4.2.4 单抗重链、轻链验证 | 第48页 |
| 4.2.5 单抗相对亲和力的测定 | 第48页 |
| 4.2.6 单抗的抗原结合位点鉴定 | 第48页 |
| 4.2.7 单抗杂交瘤细胞的稳定性 | 第48-49页 |
| 4.3 结果 | 第49-53页 |
| 4.3.1 单抗杂交瘤细胞培养上清及部分杂交瘤株小鼠腹水效价的测定 | 第49页 |
| 4.3.2 单抗杂交瘤细胞的染色体分析 | 第49-50页 |
| 4.3.3 单克隆抗体亚类的鉴定 | 第50页 |
| 4.3.4 单克隆抗体重链、轻链分子质量测定 | 第50-51页 |
| 4.3.5 单克隆抗体相对亲和力的测定 | 第51页 |
| 4.3.6 单克隆抗体识别抗原表位鉴定结果 | 第51-52页 |
| 4.3.7 单克隆抗体杂交瘤细胞的稳定性鉴定 | 第52-53页 |
| 4.4 讨论 | 第53-55页 |
| 第五章 双抗体夹心ELISA法的建立与初步应用 | 第55-70页 |
| 5.1 材料 | 第55-57页 |
| 5.1.1 罗非鱼阴性阳性样品 | 第55页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第55页 |
| 5.1.3 试剂的配制 | 第55-57页 |
| 5.1.4 主要仪器及耗材 | 第57页 |
| 5.2 方法 | 第57-60页 |
| 5.2.1 正辛酸—饱和硫酸铵法纯化腹水单抗 | 第57页 |
| 5.2.2 蛋白G亲和层析法纯化单克隆抗体 | 第57-58页 |
| 5.2.3 HRP标记腹水单抗 | 第58-59页 |
| 5.2.4 酶标抗体活性的鉴定 | 第59页 |
| 5.2.5 酶量、IgG量、酶标记率和克分子比的测定 | 第59页 |
| 5.2.6 双抗体夹心ELISA法的初步建立 | 第59-60页 |
| 5.2.7 实验感染样本的检测 | 第60页 |
| 5.3 结果与分析 | 第60-68页 |
| 5.3.1 腹水单抗的正辛酸—饱和硫酸铵法纯化 | 第60-61页 |
| 5.3.2 腹水单抗初提及亲和层析纯化结果 | 第61-62页 |
| 5.3.3 腹水单抗标记结果 | 第62页 |
| 5.3.4 酶标抗体的活性的确定 | 第62-63页 |
| 5.3.5 单抗最佳包被浓度及酶标抗体最佳稀释度的确定 | 第63-64页 |
| 5.3.6 夹心ELISA方法的条件优化 | 第64页 |
| 5.3.7 双抗体夹心ELISA法检测阴阳性抗原临界值的确定 | 第64页 |
| 5.3.8 敏感性实验 | 第64-65页 |
| 5.3.9 特异性实验 | 第65-66页 |
| 5.3.10 双抗体夹心ELISA法检测感染鱼不同组织样品浸出液中链球菌的结果 | 第66-68页 |
| 5.4 讨论 | 第68-70页 |
| 第六章 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第79-80页 |
| 申明 | 第80页 |
