| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7页 |
| ABBREVIATIONS | 第13-15页 |
| CHAPTER Ⅰ LITERATURE REVIEW | 第15-36页 |
| 1.1 ADENOVIRUS | 第15-16页 |
| 1.1.1 Adenovirus classification | 第15-16页 |
| 1.2 ATADENOVIRUS | 第16-17页 |
| 1.3 EGG DROP SYNDROME VIRUS (EDSV) | 第17-28页 |
| 1.3.1 Genome organization and replication | 第18-22页 |
| 1.3.2 Adsorption and entry | 第22-24页 |
| 1.3.3 Pathogenesis | 第24-25页 |
| 1.3.4 Transmission of EDSV | 第25-26页 |
| 1.3.5 Diagnosis of infection | 第26-27页 |
| 1.3.6 Prevention and control | 第27-28页 |
| 1.4 ADENOVIRUS VECTORS | 第28页 |
| 1.5 PROTEIN-PROTEIN INTERACTION | 第28-35页 |
| 1.5.1 Yeast-Two hybrid system | 第30-33页 |
| 1.5.1.1 Matchmaker GAL4 Two-hybrid system | 第31-32页 |
| 1.5.1.2 Reporter genes and three different binding sites | 第32-33页 |
| 1.5.2 GST-pull down assay | 第33-35页 |
| 1.6 OBJECTIVES | 第35-36页 |
| CHAPTER Ⅱ REAL-TIME FLUORESCENCE LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION ASSAY FOR DIRECT DETECTION OF EGG DROP SYNDROME VIRUS | 第36-48页 |
| 2.1 INTRODUCTION | 第36-37页 |
| 2.2 MATERIALS AND METHOD | 第37-41页 |
| 2.2.1 Chemicals and reagents | 第37-38页 |
| 2.2.2 Viruses | 第38页 |
| 2.2.3 Inoculation of embryonated duck eggs with the EDSV | 第38页 |
| 2.2.4 Cell culture and virus inoculation | 第38-39页 |
| 2.2.5 Viral DNA extraction | 第39页 |
| 2.2.6 Design of primers for the Real Amp and PCR | 第39页 |
| 2.2.7 Real Amp assay | 第39-40页 |
| 2.2.8 Specificity and sensitivity of the Real Amp assay | 第40页 |
| 2.2.9 Conventional PCR | 第40-41页 |
| 2.3 RESULTS | 第41-48页 |
| 2.3.1 Real Amp of EDSV DNA | 第42-43页 |
| 2.3.2 Direct Real Amp assay | 第43-45页 |
| 2.3.3 Specificity of the Real Amp method | 第45-46页 |
| 2.3.4 Sensitivity of the Real Amp assay | 第46-48页 |
| CHAPTER Ⅲ YEAST TWO-HYBRID SCREENING | 第48-78页 |
| 3.1 INTRODUCTION | 第48-49页 |
| 3.2 MATERIALS AND METHODS | 第49-54页 |
| 3.2.1 Preparation of duck embryos fibroblast cell culture | 第49-50页 |
| 3.2.2 Total RNA extraction from duck embryo fibroblast cell culture | 第50-51页 |
| 3.2.3 First-Strand c DNA Synthesis | 第51-52页 |
| 3.2.4 The ligation of c DNA into p GADT7 vector | 第52页 |
| 3.2.5 Preparation of Y187 and Y2H Gold competent yeast cells | 第52-53页 |
| 3.2.6 Transformation of competent Y187 yeast cells with duck c DNA library plasmids | 第53-54页 |
| 3.3 CONSTRUCTION OF PGBKT7-PENTON BAIT FUSION VECTOR | 第54-60页 |
| 3.3.1 PCR amplification of penton gene | 第54-55页 |
| 3.3.1.1 DNA extraction | 第54页 |
| 3.3.1.2 Primer design | 第54-55页 |
| 3.3.1.3 PCR | 第55页 |
| 3.3.2 Gel purification of PCR product | 第55-56页 |
| 3.3.3 Ligation of penton gene into p MD19T simple vector | 第56页 |
| 3.3.4 Transformation of p MD19T-penton into E.coli competent cells | 第56-58页 |
| 3.3.4.1 Preparation of media and solutions | 第56-57页 |
| 3.3.4.2 Preparation of E. coli DH5α competent cells | 第57页 |
| 3.3.4.3 Transformation of ligation mixture into E. coli | 第57-58页 |
| 3.3.5 PCR for positive colonies | 第58页 |
| 3.3.6 Plasmid extraction | 第58页 |
| 3.3.7 Insertion of penton gene into p GBKT7 bait vector | 第58-59页 |
| 3.3.7.1 Restriction enzyme digestion | 第58-59页 |
| 3.3.7.2 Ligation of penton into p GBKT7 bait vector | 第59页 |
| 3.3.8 Transformation of p GBKT7-penton plasmid into Y2H Gold cells | 第59-60页 |
| 3.3.8.1 Yeast colony PCR | 第60页 |
| 3.4 YEAST TWO‐HYBRID SCREENING USING YEAST MATING | 第60-62页 |
| 3.4.1 Yeast plasmid extraction | 第62页 |
| 3.4.2 PCR analysis to eliminate duplicate clones | 第62页 |
| 3.5 CONFIRMATION OF POSITIVE INTERACTIONS | 第62-63页 |
| 3.5.1 Co-transformation | 第62-63页 |
| 3.6 RESULTS | 第63-78页 |
| 3.6.1 Characterization of c DNA library | 第63-65页 |
| 3.6.2 Construction of p GBKT7-penton bait fusion plasmid | 第65-67页 |
| 3.6.3 Verification of p GBKT7-penton expression in Y2H Gold cells | 第67-69页 |
| 3.6.4 Identification of interaction partners by library screening | 第69-71页 |
| 3.6.5 Confirmation of positive interactors by co-transformation into Y2H Gold cells | 第71-73页 |
| 3.6.6 Characterization of prey candidate interaction partners | 第73-78页 |
| 3.6.6.1 Anas platyrhynchos GABA type A receptor associated protein like 1 (GABARAPL1) | 第73-74页 |
| 3.6.6.2 Anas platyrhynchos ribosomal protein SA (RPSA) or 40S ribosomal protein . | 第74-75页 |
| 3.6.6.3 Anas platyrhynchos integrin subunit alpha 4 (ITGA4) gene | 第75-77页 |
| 3.6.6.4 Anas platyrhynchos actin beta (ACTB) | 第77-78页 |
| CHAPTER Ⅳ CONFIRMATION OF THE INTERACTION BETWEEN BAIT PROTEIN (PGBKT7: PENTON) AND PREY PROTEINS (GABARAPL1 AND RPSA) | 第78-97页 |
| 4.1 INTRODUCTION | 第78-80页 |
| 4.2 MATERIALS AND METHODS | 第80-85页 |
| 4.2.1 Construction of bait and prey fusion vectors for GST pull-down assay | 第80-81页 |
| 4.2.1.1 PCR amplification of bait and prey genes | 第80-81页 |
| 4.2.1.2 DNA ligation into vectors and bacterial transformation | 第81页 |
| 4.2.2 Expression of Bait fusion protein | 第81-82页 |
| 4.2.2.1 Expression of p GEX-6P-1: penton in BL21 (DE3) cells | 第82页 |
| 4.2.3 Expression of bait and prey fusion proteins in eukaryotic cells | 第82-83页 |
| 4.2.3.1 Cell culture preparation and transfection | 第82-83页 |
| 4.2.4 Detection of protein expression in mammalian cell lines | 第83-85页 |
| 4.2.4.1 Preparation of cell lysates | 第83-84页 |
| 4.2.4.2 Preparation of running, transfer and blocking buffers | 第84页 |
| 4.2.4.3 SDS polyacrylamide gel electrophoresis | 第84-85页 |
| 4.2.4.4 Western blotting | 第85页 |
| 4.3 GST PULL- DOWN ASSAY | 第85-87页 |
| 4.3.1 Purification of bait fusion protein | 第85-86页 |
| 4.3.2 GST pull-down procedure | 第86-87页 |
| 4.4 RESULTS | 第87-97页 |
| 4.4.1 Construction of p GEX-6P-1: penton plasmid | 第87-88页 |
| 4.4.2 Construction of prey plasmids | 第88-89页 |
| 4.4.3 Expression of bait protein in bacterial cells | 第89-90页 |
| 4.4.4 Expression of bait and prey proteins in mammalian cell lines | 第90-94页 |
| 4.4.5 GST pull down assay | 第94-97页 |
| CHAPTER Ⅴ DISCUSSION | 第97-102页 |
| CONCLUSION | 第102-103页 |
| REFERENCES | 第103-114页 |
| ACKNOWLEDGEMENT | 第114-116页 |
| Author Biography | 第116-117页 |
| ADDITIONAL MATERIALS | 第117-120页 |
