| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 1 引言 | 第12-18页 |
| 1.1 肝细胞癌 | 第12页 |
| 1.2 DNA甲基化与肿瘤 | 第12-15页 |
| 1.2.1 DNA甲基化 | 第12-13页 |
| 1.2.2 肿瘤中DNA的甲基化异常 | 第13-15页 |
| 1.3 DEK蛋白与肿瘤研究 | 第15-16页 |
| 1.4 研究意义 | 第16页 |
| 1.5 研究目的和内容 | 第16页 |
| 1.5.1 研究目的 | 第16页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第16页 |
| 1.6 技术路线 | 第16-18页 |
| 2 实验材料 | 第18-23页 |
| 2.1 细胞培养材料及试剂 | 第18页 |
| 2.1.1 细胞系及组织 | 第18页 |
| 2.1.2 细胞培养主要试剂 | 第18页 |
| 2.2 细菌培养材料及试剂 | 第18页 |
| 2.2.1 细菌菌株 | 第18页 |
| 2.2.2 细菌培养主要试剂 | 第18页 |
| 2.3 载体 | 第18-20页 |
| 2.3.1 BGS测序载体 | 第18-19页 |
| 2.3.2 荧光素酶报告基因系统载体 | 第19-20页 |
| 2.4 试剂及试剂盒 | 第20-22页 |
| 2.4.1 工具酶 | 第20页 |
| 2.4.2 试剂盒 | 第20页 |
| 2.4.3 主要溶液的配制 | 第20-22页 |
| 2.5 仪器设备 | 第22-23页 |
| 3 实验方法 | 第23-39页 |
| 3.1 HCC细胞系的复苏、培养与冻存 | 第23-24页 |
| 3.1.1 细胞的复苏 | 第23页 |
| 3.1.2 细胞的培养 | 第23页 |
| 3.1.3 细胞的冻存 | 第23-24页 |
| 3.2 荧光定量PCR检测HCC细胞系与正常肝细胞系/组织中DEK mRNA表达水平 | 第24-26页 |
| 3.2.1 总RNA的提取 | 第24-25页 |
| 3.2.2 RT-PCR合成cDNA第一条链 | 第25页 |
| 3.2.3 荧光定量PCR检测HCC细胞系与正常肝细胞/组织中DEK mRNA表达水平 | 第25-26页 |
| 3.3 Western blotting检测HCC细胞系与正常肝细胞系/组织中DEK蛋白表达水平 | 第26-28页 |
| 3.3.1 SDS-PAGE电泳 | 第26-27页 |
| 3.3.2 转膜 | 第27-28页 |
| 3.3.3 显影曝光 | 第28页 |
| 3.4 BGS法检测HCC细胞系与正常肝细胞系/组织DEK基因启动子甲基化水平 | 第28-33页 |
| 3.4.1 DEK基因启动子区CpG岛分析 | 第28页 |
| 3.4.2 基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| 3.4.3 基因组DNA的硫化处理 | 第29-30页 |
| 3.4.4 BSP(Bisulfite-Sequencing PCR) | 第30-31页 |
| 3.4.5 BSP产物的回收 | 第31-32页 |
| 3.4.6 BSP产物与pMD18-T载体的连接 | 第32页 |
| 3.4.7 质粒的转化与提取 | 第32-33页 |
| 3.4.8 质粒的双酶切鉴定 | 第33页 |
| 3.4.9 重组质粒的测序 | 第33页 |
| 3.4.10 DEK基因启动子甲基化状态的分析 | 第33页 |
| 3.5 双荧光素酶报告基因表达系统检测DEK基因启动子活性 | 第33-39页 |
| 3.5.1 引物设计 | 第33-34页 |
| 3.5.2 HepG2细胞培养及基因组DNA的提取 | 第34页 |
| 3.5.3 DEK启动子片段重组质粒的构建 | 第34-37页 |
| 3.5.4 转染 | 第37页 |
| 3.5.5 荧光素酶报告基因的检测 | 第37-39页 |
| 4 实验结果 | 第39-52页 |
| 4.1 焚光定量PCR检测HCC细胞系与正常肝细胞系/组织中DEKmRNA表达水平 | 第39页 |
| 4.2 Western blotting检测HCC细胞系与正常肝细胞系/组织中DEK蛋白表达水平 | 第39-41页 |
| 4.3 BGS法检测HCC细胞系与正常肝细胞系/组织DEK基因启动子甲基化水平 | 第41-47页 |
| 4.3.1 DEK基因上游区域的CpG岛分析 | 第41页 |
| 4.3.2 HCC细胞系DEK基因BSP结果 | 第41-42页 |
| 4.3.3 重组质粒的双酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 4.3.4 重组质粒的测序结果 | 第43-44页 |
| 4.3.5 DEK基因启动子CpG岛甲基化位点图谱 | 第44-45页 |
| 4.3.6 各个细胞系及组织DEK启动子甲基化水平与DEK表达量关联分析 | 第45-46页 |
| 4.3.7 DEK基因启动子区域CpG岛序列中可能的转录因子结合位点分析 | 第46-47页 |
| 4.4 双荧光素酶报告基因表达系统检测甲基化/非甲基化的DEK基因启动子活性 | 第47-52页 |
| 4.4.1 DEK启动子片段重组质粒的构建 | 第48-49页 |
| 4.4.2 DEK基因启动子CpG岛片段甲基化处理及pGL3-DEK/CpG 1(Me)、pGL3-DEK/CpG2-1 (Me)、pGL3-DEK/CpG2-2(Me)和pGL3-DEK/CpG3(Me)重组质粒的构建 | 第49-51页 |
| 4.4.3 利用荧光素酶报告基因表达系统检测启动子活性 | 第51-52页 |
| 5 讨论 | 第52-54页 |
| 6 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 附录A | 第58-59页 |
| 作者简历 | 第59-61页 |
| 学位论文数据集 | 第61页 |
