| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-20页 |
| 第一章 绪论 | 第20-48页 |
| ·蛋白质内含子的发现及命名 | 第20-22页 |
| ·蛋白质内含子的分类和保守模体 | 第22-24页 |
| ·蛋白质内含子的结构 | 第24-29页 |
| ·蛋白质内含子的一级结构 | 第25-27页 |
| ·蛋白质内含子的高级结构 | 第27-29页 |
| ·蛋白质内含子的剪接机制 | 第29-33页 |
| ·蛋白质内含子的顺式剪接(cis-splicing)机制 | 第29-32页 |
| ·断裂蛋白质内含子的反式剪接(trans-splicing)机制 | 第32-33页 |
| ·蛋白质内含子的进化 | 第33-35页 |
| ·蛋白质内含子的应用 | 第35-41页 |
| ·Intein介导的蛋白质纯化 | 第36-38页 |
| ·Intein介导的蛋白质连接(EPL或IPL) | 第38-39页 |
| ·Intein介导的蛋白质环化 | 第39-40页 |
| ·利用intein合成毒素蛋白 | 第40-41页 |
| ·Intein作为分子开关控制目的蛋白的活性 | 第41页 |
| ·本文的研究内容及意义 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-48页 |
| 第二章 材料和方法 | 第48-67页 |
| ·实验材料 | 第48-49页 |
| ·蛋白质内含子 | 第48-49页 |
| ·酶与试剂 | 第49页 |
| ·DNA实验基本技术 | 第49-54页 |
| ·质粒转化感受态细胞 | 第50-51页 |
| ·质粒提取 | 第51页 |
| ·PCR | 第51-53页 |
| ·DNA凝胶回收 | 第53-54页 |
| ·DNA酶切与连接 | 第54页 |
| ·蛋白质实验基本技术 | 第54-57页 |
| ·重组蛋白诱导表达 | 第54-55页 |
| ·蛋白纯化 | 第55-56页 |
| ·蛋白复性 | 第56页 |
| ·蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第56页 |
| ·Western-blot印迹 | 第56-57页 |
| ·蛋白质体外剪接实验 | 第57-58页 |
| ·蛋白冷冻干燥 | 第58页 |
| ·电纺 | 第58页 |
| ·微小蛋白质内含子和断裂蛋白质内含子的构建 | 第58-67页 |
| ·微小蛋白质内含子的构建 | 第59-62页 |
| ·断裂蛋白质内含子的构建 | 第62-64页 |
| ·GG-SAG断裂蛋白质内含子的构建 | 第64-65页 |
| ·Western-blot检测mini-intein和split-intein的剪接活性 | 第65-67页 |
| 第三章 Intein剪接位点的保守氨基酸残基突变研究 | 第67-81页 |
| ·研究背景 | 第67-69页 |
| ·材料方法 | 第69-70页 |
| ·Intein序列和质粒构建 | 第69页 |
| ·蛋白表达 | 第69-70页 |
| ·结果 | 第70-77页 |
| ·讨论 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-81页 |
| 第四章 S1和S11型断裂蛋白内含子的诱发断裂 | 第81-95页 |
| ·研究背景 | 第81-82页 |
| ·实验设计原理 | 第82-84页 |
| ·实验目的 | 第84页 |
| ·结果 | 第84-91页 |
| ·IcT融合蛋白的构建,表达和纯化 | 第84-85页 |
| ·用S1-I_N小肽诱发前体蛋白IcT发生C-cleavage | 第85-89页 |
| ·MIN融合蛋白的构建,表达和纯化 | 第89页 |
| ·用S11-I_C小肽诱发前体蛋白MIN发生N-cleavage | 第89-91页 |
| ·讨论 | 第91-93页 |
| ·结论 | 第93页 |
| 参考文献 | 第93-95页 |
| 第五章 缺失Motif A的Ssp DnaX的自发C-cleavage | 第95-107页 |
| ·研究背景 | 第95-96页 |
| ·材料方法 | 第96-97页 |
| ·质粒构建 | 第96-97页 |
| ·蛋白表达,纯化和断裂反应 | 第97页 |
| ·结果 | 第97-103页 |
| ·将Ssp DnaX intein构建为mini-intein和split-intein | 第97-99页 |
| ·S1-I_c的自发断裂 | 第99-101页 |
| ·切除更多氨基酸残基后的IcT的自发C-cleavage | 第101-102页 |
| ·IcT中Block B的保守氨基酸残基突变后对C-cleavage的影响 | 第102-103页 |
| ·讨论 | 第103-105页 |
| ·结论 | 第105页 |
| 参考文献 | 第105-107页 |
| 第六章 基于intein的蛋白质剪接技术的应用 | 第107-147页 |
| 第一部分 用蛋白质反式剪接体系剪接蜘蛛丝蛋白 | 第107-129页 |
| ·研究背景 | 第107-113页 |
| ·蜘蛛丝的种类及性能 | 第107-109页 |
| ·蜘蛛丝的特性及应用前景 | 第109-111页 |
| ·蜘蛛丝蛋白基因克隆和纺丝研究 | 第111页 |
| ·本课题的研究目的和意义 | 第111-113页 |
| ·实验材料和方法 | 第113-119页 |
| ·蜘蛛丝编码基因的合成与克隆 | 第113-114页 |
| ·构建表达载体 | 第114-116页 |
| ·将蜘蛛丝的编码基因克隆到表达载体中 | 第116-117页 |
| ·融合蛋白的表达与纯化 | 第117-118页 |
| ·蛋白体外剪接 | 第118页 |
| ·电纺 | 第118-119页 |
| ·结果与讨论 | 第119-127页 |
| ·蛋白质反式剪接体系的建立 | 第119-122页 |
| ·前体蛋白的纯化和体外剪接 | 第122-125页 |
| ·剪接产物的静电纺丝和性能测试 | 第125-127页 |
| ·结论 | 第127-129页 |
| 第二部分 用蛋白质内含子剪接毒性蛋白RicinA | 第129-144页 |
| ·研究背景 | 第129-132页 |
| ·蓖麻毒蛋白的结构及作用机理 | 第129-130页 |
| ·蓖麻毒蛋白的应用 | 第130-131页 |
| ·本课题的研究目的和意义 | 第131-132页 |
| ·研究方法和技术路线 | 第132-133页 |
| ·实验方法和结果 | 第133-144页 |
| ·体内剪接融合蛋白表达质粒的构建和剪接结果 | 第133-140页 |
| ·体外剪接融合蛋白表达质粒的构建和剪接结果 | 第140-144页 |
| ·结论 | 第144页 |
| 参考文献 | 第144-147页 |
| 第七章 结论与展望 | 第147-150页 |
| ·结论 | 第147-149页 |
| ·展望 | 第149-150页 |
| 博士期间发表论文和参加科研情况说明 | 第150-151页 |
| 致谢 | 第151-152页 |
| 附录:Media and Buffer | 第152-154页 |
