| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩写符号术语表 | 第12-13页 |
| 第一章 综述 | 第13-27页 |
| 1.1 腈水合酶 | 第13-21页 |
| 1.1.1 腈水合酶的来源与种类 | 第13-14页 |
| 1.1.2 腈水合酶的基因序列特征 | 第14-15页 |
| 1.1.3 腈水合酶的结构特征 | 第15-16页 |
| 1.1.4 腈水合酶的催化机理 | 第16-17页 |
| 1.1.5 腈水合酶的重组表达及活化元件 | 第17-20页 |
| 1.1.6 腈水合酶的应用 | 第20-21页 |
| 1.2 氰戊菊酯 | 第21-23页 |
| 1.2.1 氰戊菊酯的简介 | 第21-22页 |
| 1.2.2 生物催化法制备氰戊菊酯前体戊菊酸 | 第22-23页 |
| 1.3 酶的分子改造 | 第23-26页 |
| 1.3.1 定向进化 | 第23-24页 |
| 1.3.2 理性设计 | 第24页 |
| 1.3.3 半理性设计 | 第24-26页 |
| 1.4 本课题的研究思路与主要内容 | 第26-27页 |
| 第二章 腈水合酶NHaseK在大肠杆菌中的功能表达 | 第27-49页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 材料与试剂 | 第27-29页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第27页 |
| 2.2.2 质粒与菌种 | 第27-28页 |
| 2.2.3 药品与试剂 | 第28页 |
| 2.2.4 溶液与培养基的配制 | 第28-29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-36页 |
| 2.3.1 质粒的提取 | 第29页 |
| 2.3.2 目的基因片段的扩增 | 第29-31页 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 | 第31-32页 |
| 2.3.4 重组质粒的转化和验证 | 第32页 |
| 2.3.5 重组酶的诱导表达 | 第32页 |
| 2.3.6 重组酶的纯化 | 第32-33页 |
| 2.3.7 SDS-PAGE | 第33页 |
| 2.3.8 蛋白浓度的测定 | 第33-34页 |
| 2.3.9 底物与产物浓度的测定 | 第34-35页 |
| 2.3.10 酶活的定义与测量 | 第35-36页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第36-48页 |
| 2.4.1 采用pETDuet-1实现NHaseK各亚基的平衡表达 | 第36-43页 |
| 2.4.1.1 以pETDuet-1为载体的表达策略设计 | 第36-38页 |
| 2.4.1.2 以pETDuet-1为载体的重组质粒的构建 | 第38-39页 |
| 2.4.1.3 NHaseK以pETDuet-1为载体时的表达与活力 | 第39-42页 |
| 2.4.1.4 重组酶的纯化与最佳表达策略的确定 | 第42-43页 |
| 2.4.2 质粒拷贝数对表达NHaseK的影响 | 第43-45页 |
| 2.4.2.1 以不同质粒为载体构建NHaseK的重组质粒 | 第43-44页 |
| 2.4.2.2 NHaseK在不同质粒中的表达与活力 | 第44-45页 |
| 2.4.3 SD序列对表达NHaseK的影响 | 第45-48页 |
| 2.4.3.1 SD序列的设计 | 第45页 |
| 2.4.3.2 优化NHaseK的SD序列 | 第45-47页 |
| 2.4.3.3 SD优化重组质粒的表达 | 第47-48页 |
| 2.5 本章小结 | 第48-49页 |
| 第三章 腈水合酶NHaseK的半理性设计 | 第49-68页 |
| 3.1 引言 | 第49页 |
| 3.2 材料与试剂 | 第49-50页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第49页 |
| 3.2.2 质粒与菌株 | 第49页 |
| 3.2.3 药品与试剂 | 第49-50页 |
| 3.2.4 溶液与培养基的配制 | 第50页 |
| 3.3 实验方法 | 第50-52页 |
| 3.3.1 同源建模 | 第50页 |
| 3.3.2 分子对接 | 第50页 |
| 3.3.3 虚拟丙氨酸扫描 | 第50页 |
| 3.3.4 虚拟定点饱和突变 | 第50页 |
| 3.3.5 定点突变引物设计 | 第50-52页 |
| 3.3.6 突变子的构建 | 第52页 |
| 3.3.7 突变酶的表达与纯化 | 第52页 |
| 3.3.8 突变酶的活力测定 | 第52页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第52-67页 |
| 3.4.1 腈水合酶NHaseK的同源建模 | 第52-55页 |
| 3.4.2 NHaseK与底物CPIN的分子对接 | 第55-56页 |
| 3.4.3 基于虚拟丙氨酸扫描的半理性设计 | 第56-65页 |
| 3.4.3.1 NHaseK的虚拟丙氨酸扫描 | 第56-57页 |
| 3.4.3.2 结合虚拟饱和突变的半理性设计 | 第57-60页 |
| 3.4.3.3 结合丙氨酸突变实验的半理性设计 | 第60-65页 |
| 3.4.4 基于预测通道的半理性设计 | 第65-66页 |
| 3.4.5 组合突变 | 第66-67页 |
| 3.5 本章小结 | 第67-68页 |
| 第四章 突变子βD49G与原始酶的酶学性质及催化工艺对比 | 第68-83页 |
| 4.1 引言 | 第68页 |
| 4.2 材料与试剂 | 第68-69页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第68页 |
| 4.2.2 质粒与菌种 | 第68页 |
| 4.2.3 药品与试剂 | 第68-69页 |
| 4.2.4 溶液与培养基的配制 | 第69页 |
| 4.3 实验方法 | 第69-72页 |
| 4.3.1 酶学性质研究 | 第69-70页 |
| 4.3.1.1 温度对重组酶的影响 | 第69页 |
| 4.3.1.2 pH对重组酶影响 | 第69-70页 |
| 4.3.1.3 重组酶的动力学参数 | 第70页 |
| 4.3.2 催化工艺研究 | 第70-71页 |
| 4.3.2.1 温度对全细胞转化CPIN的影响 | 第70页 |
| 4.3.2.2 pH对全细胞转化CPIN的影响 | 第70-71页 |
| 4.3.2.3 助溶剂甲醇浓度对全细胞转化CPIN的影响 | 第71页 |
| 4.3.2.4 细胞量对转化过程的影响 | 第71页 |
| 4.3.3 细胞干重的测定 | 第71-72页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第72-81页 |
| 4.4.1 βD49G与NHaseK的酶学性质对比 | 第72-77页 |
| 4.4.1.1 温度对βD49G与NHaseK的影响 | 第72-75页 |
| 4.4.1.2 pH对βD49G与NHaseK的影响 | 第75-76页 |
| 4.4.1.3 βD49G与NHaseK的动力学参数 | 第76-77页 |
| 4.4.2 βD49G与NHaseK的全细胞催化工艺对比 | 第77-81页 |
| 4.4.2.1 全细胞转化温度的确定 | 第77-78页 |
| 4.4.2.2 全细胞转化pH的确定 | 第78-79页 |
| 4.4.2.3 助溶剂甲醇浓度的确定 | 第79-80页 |
| 4.4.2.4 细胞量的确定 | 第80-81页 |
| 4.5 本章小结 | 第81-83页 |
| 第五章 结论与展望 | 第83-85页 |
| 5.1 结论 | 第83-84页 |
| 5.2 展望 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-92页 |
| 附录 | 第92页 |
| 附录Ⅰ 主要实验仪器设备 | 第92-93页 |
| 附录Ⅱ 主要实验试剂 | 第93-94页 |
| 附录Ⅲ 腈水合酶NHaseK基因序列 | 第94-95页 |
| 附录Ⅳ 质粒图谱 | 第95-98页 |
| 作者简介 | 第98页 |
