| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 缩略词索引 | 第17-19页 |
| 实验用质粒与菌种以及细胞 | 第19-20页 |
| 实验仪器和设备 | 第20-22页 |
| 实验试剂 | 第22-25页 |
| 实验试剂配方 | 第25-28页 |
| 第一章 前言 | 第28-46页 |
| 1.1 癌症 | 第28-29页 |
| 1.1.1 简介 | 第28页 |
| 1.1.2 癌症的危害 | 第28-29页 |
| 1.2 RAF激酶 | 第29-32页 |
| 1.2.1 简介 | 第29-31页 |
| 1.2.2 Raf激酶突变 | 第31-32页 |
| 1.3 细胞周期 | 第32-34页 |
| 1.3.1 简介 | 第32-33页 |
| 1.3.2 细胞周期与癌症 | 第33-34页 |
| 1.4 SMC3 | 第34-36页 |
| 1.5 MSS1 | 第36-37页 |
| 1.6 本论文研究意义 | 第37-38页 |
| 1.7 实验方案与技术路线 | 第38-46页 |
| 1.7.1 构建质粒 | 第38-39页 |
| 1.7.2 构建突变质粒 | 第39-40页 |
| 1.7.3 构建稳定细胞系,用western blot方法检测蛋白表达 | 第40-42页 |
| 1.7.4 Co-IP(免疫沉淀法) | 第42-43页 |
| 1.7.5 多维蛋白质鉴定技术(MudPIT) | 第43-46页 |
| 第二章 构建VSV-B-RAF~(WT)和VSV-C-RAF~(WT)质粒 | 第46-66页 |
| 2.1 实验内容 | 第46-57页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第46页 |
| 2.1.2 普通PCR扩增目的片段VSV-B-Raf和VSV-C-Raf | 第46-49页 |
| 2.1.3 胶回收(promega) | 第49-50页 |
| 2.1.4 VSV-B-Raf的限制性内切酶反应 | 第50页 |
| 2.1.5 VSV-C-Raf的限制性内切酶反应 | 第50-51页 |
| 2.1.6 胶回收酶切验证的琼脂糖凝胶 | 第51-52页 |
| 2.1.7 连接反应 | 第52-53页 |
| 2.1.8 E.coli DH 5α感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 2.1.9 转化(E.coli DH 5α感受态细胞) | 第53-54页 |
| 2.1.10 挑克隆摇菌,验证 | 第54-56页 |
| 2.1.11 抽提质粒 | 第56页 |
| 2.1.12 比对序列 | 第56-57页 |
| 2.1.13 质粒大提(QIAGEN kit) | 第57页 |
| 2.2 实验结果 | 第57-64页 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳验证PCR效果 | 第57-58页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳验证胶回收产物 | 第58-59页 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物 | 第59页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳验证胶回收产物 | 第59-60页 |
| 2.2.5 菌落PCR验证 | 第60-61页 |
| 2.2.6 酶切验证 | 第61页 |
| 2.2.7 测序结果比对 | 第61-64页 |
| 2.3 小结与讨论 | 第64-66页 |
| 第三章 突变产生VSV-B-RAF~(V600E)和VSV-C-RAF~(S2470)质粒 | 第66-76页 |
| 3.1 实验内容 | 第66-69页 |
| 3.1.1 引物设计 | 第66-67页 |
| 3.1.2 PCR突变法得到VSV-B-Raf~(V600E) | 第67-68页 |
| 3.1.3 TOYOBO突变试剂盒突变得到VSV-C-Raf~(S247G) | 第68页 |
| 3.1.4 用Dpn I对模板质粒DNA进行消化 | 第68-69页 |
| 3.1.5 转化 | 第69页 |
| 3.1.6 突变体的确认 | 第69页 |
| 3.2 实验结果 | 第69-74页 |
| 3.2.1 琼脂糖凝胶电泳验证Dpn I消化模板 | 第69-70页 |
| 3.2.2 酶切验证 | 第70-71页 |
| 3.2.3 测序比对结果 | 第71-74页 |
| 3.3 小结与讨论 | 第74-76页 |
| 第四章 稳定细胞系的构建及验证 | 第76-92页 |
| 4.1 实验内容 | 第76-86页 |
| 4.1.1 实验方法 | 第76-79页 |
| 4.1.2 构建稳定细胞系 | 第79-81页 |
| 4.1.3 DOX浓度梯度诱导 | 第81-82页 |
| 4.1.4 DOX时间梯度诱导 | 第82-84页 |
| 4.1.5 western blot检测 | 第84-86页 |
| 4.2 实验结果 | 第86-90页 |
| 4.2.1 western blot检测浓度梯度 | 第86-88页 |
| 4.2.2 western blot检测时间梯度 | 第88-90页 |
| 4.3 小结与讨论 | 第90-92页 |
| 第五章 用CO-IP和蛋白互作组学的方法系统识别与C-RAF激酶结合的蛋白 | 第92-112页 |
| 5.1 实验内容 | 第92-102页 |
| 5.1.1 实验方法 | 第92-96页 |
| 5.1.2 Co-IP实验 | 第96-97页 |
| 5.1.3. western blot检测 | 第97-98页 |
| 5.1.4 银染实验 | 第98-99页 |
| 5.1.5 Co-IP洗脱法 | 第99-100页 |
| 5.1.6 Co-IP验证VSV-C-Raf~(WT),VSV-C-Raf~(S247G)结合蛋白SMC3和MSS1 | 第100-102页 |
| 5.2 实验结果 | 第102-110页 |
| 5.2.1 western blot检测VSV-B-Raf~(WT),VSV-B-Raf~(V600E)的IP效果 | 第102-103页 |
| 5.2.2 银染结果鉴定VSV-B-Raf~(WT),VSV-B-Raf~(V600E)的相互作用蛋白 | 第103页 |
| 5.2.3 western blot检测VSV-C-Raf~(WT),VSV-C-Raf~(S247G)的IP效果 | 第103-104页 |
| 5.2.4 银染结果鉴定VSV-C-Raf~(WT),VSV-C-Raf~(S247G)的相互作用蛋白 | 第104-105页 |
| 5.2.5 质谱结果分析 | 第105-110页 |
| 5.2.6 western blot检测SMC3,MSS1 | 第110页 |
| 5.3 小结与讨论 | 第110-112页 |
| 第六章 总结 | 第112-114页 |
| 致谢 | 第114-116页 |
| 参考文献 | 第116-122页 |
| 附录A B-RAF编码基因序列 | 第122-124页 |
| 附录B C-RAF编码基因序列 | 第124-126页 |
| 附录C 攻读硕士期间发表论文目录 | 第126页 |
