| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第1章 引言 | 第10-23页 |
| 1.1 酵母表达系统简述 | 第10-14页 |
| 1.1.1 酿酒酵母表达系统 | 第10-11页 |
| 1.1.2 甲醇酵母表达系统 | 第11-12页 |
| 1.1.3 裂殖酵母表达系统 | 第12-14页 |
| 1.2 粟酒裂殖酵母表达载体 | 第14-19页 |
| 1.2.1 表达载体种类 | 第14-17页 |
| 1.2.2 常用启动子 | 第17-18页 |
| 1.2.3 常用筛选标记 | 第18-19页 |
| 1.3 立题背景及研究内容 | 第19-23页 |
| 1.3.1 立题背景 | 第20-21页 |
| 1.3.2 本文研究内容 | 第21-23页 |
| 第2章 粟酒裂殖酵母高表达持家基因的筛选及鉴定 | 第23-34页 |
| 2.1 材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 菌株 | 第23页 |
| 2.1.2 培养基 | 第23页 |
| 2.1.3 主要试剂及其来源 | 第23-24页 |
| 2.1.4 主要设备及其来源 | 第24页 |
| 2.2 方法 | 第24-27页 |
| 2.2.1 不同生长时期酵母细胞的收集 | 第24-25页 |
| 2.2.2 酵母细胞破碎及蛋白提取 | 第25页 |
| 2.2.3 硫酸铵分级沉淀 | 第25页 |
| 2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第25-26页 |
| 2.2.5 蛋白质转PVDF膜及N端测序 | 第26-27页 |
| 2.3 结果与分析 | 第27-32页 |
| 2.3.1 高表达持家基因的筛选 | 第27-28页 |
| 2.3.2 高丰度蛋白的分离 | 第28-29页 |
| 2.3.3 蛋白质N端测序结果 | 第29-30页 |
| 2.3.4 所测氨基酸序列进行BlastP比对分析 | 第30-32页 |
| 2.4 讨论 | 第32-34页 |
| 第3章 两种组成型启动子的分析与比较 | 第34-56页 |
| 3.1 材料 | 第34-37页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第34页 |
| 3.1.2 主要试剂及来源 | 第34-35页 |
| 3.1.3 培养基 | 第35-37页 |
| 3.1.4 主要设备及其来源 | 第37页 |
| 3.2 方法 | 第37-43页 |
| 3.2.1 一般基因操作方法 | 第37-38页 |
| 3.2.2 裂殖酵母基因组DNA的提取和检测 | 第38-39页 |
| 3.2.3 裂殖酵母感受态细胞的制备及醋酸锂转化 | 第39-40页 |
| 3.2.4 担体鲑鱼精DNA的制备 | 第40页 |
| 3.2.5 持家基因eno101与gpd3基因上游序列的生物信息学分析 | 第40页 |
| 3.2.6 质粒pREP3X-lacZ的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.7 质粒pREP3X-lacZ中nmt启动子的替换 | 第41-42页 |
| 3.2.8 lacZ酶活分析 | 第42-43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-54页 |
| 3.3.0 eno101基因的上游序列特征 | 第43-45页 |
| 3.3.1 gpd3基因的上游序列特征 | 第45-47页 |
| 3.3.2 pREP3X-lacZ质粒的构建 | 第47-48页 |
| 3.3.3 eno101上游序列替换质粒pREP3X-lacZ中的nmt启动子 | 第48-50页 |
| 3.3.4 gpd3上游序列替换pREP3X-lacZ中的nmt启动子 | 第50-51页 |
| 3.3.5 eno101启动子位置的确定 | 第51-52页 |
| 3.3.6 gpd3启动子位置的确定 | 第52-53页 |
| 3.3.7 两种组成型启动子控制下的lacZ酶活比较 | 第53-54页 |
| 3.4 讨论 | 第54-56页 |
| 第4章 大肠杆菌和粟酒裂殖酵母共用筛选标记的研究 | 第56-80页 |
| 4.1 材料 | 第56-58页 |
| 4.1.1 菌株及质粒 | 第56-57页 |
| 4.1.2 培养基 | 第57页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第57-58页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第58页 |
| 4.2 方法 | 第58-65页 |
| 4.2.1 一般基因操作方法 | 第58页 |
| 4.2.2 裂殖酵母S.pombe Δgfa1感受态细胞制备及转化方法 | 第58-59页 |
| 4.2.3 大肠杆菌E. coliΔglmS感受态的制备及转化方法 | 第59-60页 |
| 4.2.4 gfal基因cDNA序列在E. coliΔglmS中的表达验证试验 | 第60页 |
| 4.2.5 人工设计σ~(70)类型启动子的转录激活验证试验 | 第60-61页 |
| 4.2.6 裂殖酵母gfa1基因序列的扩增 | 第61页 |
| 4.2.7 质粒pHsh-SpGfa的构建 | 第61页 |
| 4.2.8 质粒pHsh-SpGfa-term的构建 | 第61页 |
| 4.2.9 质粒pHsh-SpGfa-Δintron的构建 | 第61-62页 |
| 4.2.10 质粒pHsh-SpGfa-σ70的构建 | 第62页 |
| 4.2.11 质粒pHsh-SpGfa-SD的构建及互补验证试验 | 第62-63页 |
| 4.2.12 质粒pRep-SpGfaAleu的构建 | 第63页 |
| 4.2.13 质粒pGFA-nmt的构建 | 第63-64页 |
| 4.2.14 质粒pGFA-nmt在E. coliΔglmS和S. pombe Δgfa中的互补验证试验 | 第64页 |
| 4.2.15 酵母质粒的提取及验证 | 第64-65页 |
| 4.3 结果与分析 | 第65-78页 |
| 4.3.1 质粒pHsh-CGfa的构建及互补验证 | 第65-66页 |
| 4.3.2 质粒pHsh-glmS的构建及互补验证 | 第66-68页 |
| 4.3.3 粟酒裂殖酵母gfa1基因序列的扩增 | 第68-70页 |
| 4.3.4 质粒pHsh-SpGfa的构建 | 第70-71页 |
| 4.3.5 质粒pHsh-SpGfa-term的构建 | 第71-72页 |
| 4.3.6 质粒pHsh-SpGfa-Δintron的构建 | 第72-73页 |
| 4.3.7 质粒pHsh-SpGfa-σ70的构建 | 第73页 |
| 4.3.8 质粒pHsh-SpGfa-SD的构建及互补验证 | 第73-75页 |
| 4.3.9 质粒pRep-SpGfaΔleu的构建 | 第75-76页 |
| 4.3.10 质粒pGFA-nmt的构建 | 第76-77页 |
| 4.3.11 质粒pGFA-nmt在E. coliΔdglmS和S.pombeΔgfa中的互补验证试验 | 第77-78页 |
| 4.4 讨论 | 第78-80页 |
| 第5章 新型粟酒裂殖酵母穿梭载体的构建及应用实验 | 第80-96页 |
| 5.1 材料 | 第80-82页 |
| 5.1.1 菌株及质粒 | 第80-81页 |
| 5.1.2 培养基 | 第81页 |
| 5.1.3 主要试剂 | 第81-82页 |
| 5.1.4 主要仪器 | 第82页 |
| 5.2 方法 | 第82-85页 |
| 5.2.1 一般基因工程操作方法 | 第82-83页 |
| 5.2.2 测定转化pGFA-nmt质粒的粟酒裂殖酵母生长曲线 | 第83页 |
| 5.2.3 质粒pREP-eno-AGCX的构建 | 第83页 |
| 5.2.4 质粒pREP-gpd-AGCX的构建 | 第83-84页 |
| 5.2.5 胞外分泌蛋白的浓缩及SDS-PAGE分析 | 第84页 |
| 5.2.6 质粒pGFA-eno-CX和pGFA-gpd-CX的构建及表达分析 | 第84-85页 |
| 5.3 结果与分析 | 第85-95页 |
| 5.3.1 转化pGFA-nmt质粒的粟酒裂殖酵母生长曲线 | 第85-86页 |
| 5.3.2 质粒pREP-eno-AGCX的构建 | 第86-87页 |
| 5.3.3 质粒pREP-gpd-AGCX的构建 | 第87-89页 |
| 5.3.4 三种启动子控制下木聚糖酶的SDS-PAGE分析 | 第89-90页 |
| 5.3.5 质粒pGFA-eno-CX的构建及表达分析 | 第90-92页 |
| 5.3.6 质粒pGFA-gpd-CX的构建及表达分析 | 第92-93页 |
| 5.3.7 pGFA-eno-CX和pGFA-gpd-CX的质粒图谱 | 第93-95页 |
| 5.4 讨论 | 第95-96页 |
| 全文总结 | 第96-98页 |
| 参考文献 | 第98-106页 |
| 致谢 | 第106页 |
