| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 研究背景及文献综述 | 第12-21页 |
| 第一节 泛素连接酶Smurf1 | 第12-17页 |
| 1. 泛素蛋白酶体途径概述 | 第12页 |
| 2. HECT家族E3泛素连接酶 | 第12-14页 |
| 3. 泛素连接酶Smurf1 | 第14-17页 |
| 3.1 Smurf1的发现及结构 | 第14页 |
| 3.2 Smurf1的调控方式 | 第14-15页 |
| 3.3 Smurf1的生物学功能 | 第15-17页 |
| 第二节 磷脂激酶PIP5K1C | 第17-21页 |
| 1. 磷脂酰肌醇-4,-二磷酸(PIP2) | 第17页 |
| 2. I型磷脂酰肌醇4磷酸5激酶(PIP5K1) | 第17-18页 |
| 3. PIP5K1的调控方式 | 第18页 |
| 4. PIP5K1C | 第18-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-38页 |
| 第一节 实验材料 | 第21-27页 |
| 1. 细胞株 | 第21页 |
| 2. 质粒 | 第21页 |
| 3. 主要试剂 | 第21-23页 |
| 4. 主要抗体 | 第23页 |
| 5. shRNA和siRNA序列 | 第23-25页 |
| 6. 实验仪器和设备 | 第25-26页 |
| 7. 实验耗材 | 第26-27页 |
| 第二节 实验方法 | 第27-38页 |
| 1. 实验所需质粒的构建 | 第27-29页 |
| 2. 293T细胞株的体外培养、传代及铺板 | 第29-30页 |
| 3. 细胞转染 | 第30页 |
| 4. 蛋白质免疫印迹(Western Blot) | 第30-31页 |
| 5. 免疫共沉淀实验(Co-IP) | 第31-32页 |
| 6. Pull Down实验 | 第32页 |
| 7. 免疫荧光技术 | 第32-33页 |
| 8. 体内泛素化法(变性)实验 | 第33-34页 |
| 9. 体外泛素化实验 | 第34页 |
| 10. RT-PCR | 第34-36页 |
| 11. MTT比色法检测细胞增殖实验 | 第36页 |
| 12. Pulse chase实验 | 第36-37页 |
| 13. 流式细胞仪检测胞内Ca~(2+)含量 | 第37页 |
| 14. 荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay) | 第37-38页 |
| 第三章 结果与分析 | 第38-64页 |
| 第一节 PIP5K1C在肺癌组织中高表达且能够促进肺癌细胞增殖 | 第38-39页 |
| 第二节 Smurf1调控PIP5K1C的蛋白稳定性 | 第39-45页 |
| 1. PIP5K1C蛋白水平受泛素蛋白酶体途径调控 | 第39-40页 |
| 2. PIP5K1C的E3泛素连接酶的确定 | 第40-41页 |
| 3. 外源Smurf1调控PIP5K1C的蛋白稳定性 | 第41-43页 |
| 4. 内源Smurf1调控内源性PIP5K1C的蛋白稳定性 | 第43页 |
| 5. Smurf1能够影响PIP5K1C的半衰期 | 第43-45页 |
| 第三节 Smurf1与PIP5K1C的相互作用 | 第45-50页 |
| 1. 外源性Smurf1与PIP5K1C相互作用 | 第45页 |
| 2. 内源性Smurf1与PIP5K1C的相互作用 | 第45-46页 |
| 3. Smurf1与PIP5K1C存在直接的相互作用 | 第46-47页 |
| 4. Smurf1与PIP5K1C可以共定位 | 第47页 |
| 5. Smurf1与PIP5K1C相互作用结构域的确定 | 第47-49页 |
| 6. Smurf1的C2结构域对于调控PIP5K1C的蛋白稳定性的必要性 | 第49-50页 |
| 第四节 Smurf1促使PIP5K1C发生泛素化 | 第50-53页 |
| 1. 在体内Smurf1能够促进PIPSK1C的泛素化 | 第50页 |
| 2. 内源Smurf1能够促进PIP5K1C的泛素化 | 第50-51页 |
| 3. 在体外Smurf1能够促进PIP5K1C的泛素化 | 第51-53页 |
| 第五节 Smurf1泛素化PIP5K1C位点的确定 | 第53-57页 |
| 1. 泛素化位点的确定 | 第53-54页 |
| 2. PIP5K1C上的K255是其被Smurf1泛素化的关键性位点 | 第54-55页 |
| 3. PIP5K1C的K255位突变后,并不影响其与其他蛋白的结合 | 第55-57页 |
| 第六节 Smurf1抑制P15K1C介导的细胞增殖 | 第57-58页 |
| 第七节 Smurf1影响PIP5K1C介导的其他生物学过程 | 第58-60页 |
| 1. Smurf1抑制PIP5K1C介导的胞内Ca~(2+)含量的增加 | 第58页 |
| 2. Smurf1能够抑制PIP5K1C介导的β-catenin活性的增强 | 第58-60页 |
| 第八节 Smurf1对PIP5K1C的降解的调控机制的初步探索 | 第60-64页 |
| 1. Smurf1对PIP5K1C的降解受PKA磷酸化的调控 | 第60-61页 |
| 2. Smurf1降解PIP5K1C受Cdh1的调控 | 第61-62页 |
| 3. 关于Smurf1降解PIP5K1C调控机制的其他探索 | 第62-64页 |
| 第四章 总结与讨论 | 第64-67页 |
| 附录Ⅰ | 第67-72页 |
| 附录Ⅱ 科研成果 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
