| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第11-12页 |
| 第一章 背景与综述 | 第12-24页 |
| 1 NRAMP1研究进展 | 第12-18页 |
| 1.1 Nramp1基因的发现 | 第12页 |
| 1.2 NRAMP1的结构与功能 | 第12-13页 |
| 1.2.1 NRAMP1的结构 | 第12-13页 |
| 1.2.2 NRAMP1的功能 | 第13页 |
| 1.3 NRAMP1与疾病易感性/抗性 | 第13-15页 |
| 1.3.1 NRAMP1与人类疾病易感性/抗性的相关性 | 第13-14页 |
| 1.3.2 NRAMP1与动物疾病易感性/抗性的关系 | 第14-15页 |
| 1.4 NRAMP1提高机体抵抗胞内菌感染的机制 | 第15-17页 |
| 1.5 山羊NRAMP1蛋白的结构分析 | 第17-18页 |
| 2 定点整合转基因动物研究进展 | 第18-22页 |
| 2.1 定点整合转基因动物制备技术 | 第18-22页 |
| 3 本研究的背景与意义 | 第22-23页 |
| 4 技术路线 | 第23-24页 |
| 第二章 Nramp1定位整合克隆的制备 | 第24-43页 |
| 1 材料 | 第24-25页 |
| 1.1 质粒和山羊 | 第24页 |
| 1.2 主要试剂材料 | 第24页 |
| 1.3 仪器设备 | 第24-25页 |
| 2 方法 | 第25-31页 |
| 2.1 定位整合质粒pTM-Nramp1的构建 | 第25-28页 |
| 2.1.1 含有双loxP位点的载体 | 第25页 |
| 2.1.2 Nramp1巨噬细胞特异表达载体的构建 | 第25-26页 |
| 2.1.3 pUC57-Purocoda质粒的构建 | 第26页 |
| 2.1.4 含有双loxp位点的Nramp1巨噬细胞特异表达载体的构建 | 第26-27页 |
| 2.1.5 质粒pTM-Nramp1的构建 | 第27-28页 |
| 2.2 pTM-Nramp1和pBS185质粒的制备 | 第28页 |
| 2.3 hLYZ转基因山羊耳成纤维细胞的制备 | 第28-29页 |
| 2.3.1 hLYZ转基因山羊耳成纤维细胞的分离 | 第28-29页 |
| 2.3.2 hLYZ转基因山羊耳成纤维细胞的鉴定 | 第29页 |
| 2.4 Nramp1定位整合细胞株的制备 | 第29-31页 |
| 2.4.1 Puromycin筛选浓度的测定方案 | 第29-30页 |
| 2.4.2 pBS185与pTM-Nramp1共转染hLYZ转基因山羊耳成纤维细胞 | 第30页 |
| 2.4.3 Nramp1定位重组克隆的鉴定 | 第30-31页 |
| 3 结果 | 第31-40页 |
| 3.1 构建Nramp1定位整合质粒pTM-Nramp1 | 第31-33页 |
| 3.1.1 2loxp-Nramp1巨噬细胞特异表达载体的构建 | 第31-32页 |
| 3.1.2 质粒pTM-Nramp1的构建 | 第32-33页 |
| 3.2 质粒pBS185的制备 | 第33-34页 |
| 3.3 hLYZ转基因山羊耳成纤维细胞的鉴定 | 第34-36页 |
| 3.3.1 hLYZ转基因山羊耳成纤维细胞的分离培养 | 第34页 |
| 3.3.2 hLYZ转基因山羊耳成纤维细胞的鉴定 | 第34-36页 |
| 3.4 Nramp1定位整合细胞株的制备 | 第36-40页 |
| 3.4.1 Puromycin筛选浓度的测定 | 第36页 |
| 3.4.2 pBS185质粒与pTM-Nramp1质粒共转染hLYZ山羊耳成纤维细胞 | 第36页 |
| 3.4.3 Nramp1定位整合细胞株的鉴定 | 第36-40页 |
| 4 讨论 | 第40-43页 |
| 4.1 改造的Nramp1基因 | 第40-41页 |
| 4.2 突变的Cre/loxp系统 | 第41页 |
| 4.3 frt序列的引入 | 第41-43页 |
| 第三章 Nramp1定位整合克隆的体细胞克隆 | 第43-58页 |
| 1 主要试剂材料 | 第43页 |
| 2 仪器设备 | 第43-44页 |
| 3 方法 | 第44-48页 |
| 3.1 卵母细胞制备与受体羊的同步 | 第44-45页 |
| 3.2 克隆细胞株的饥饿处理 | 第45-46页 |
| 3.3 重构胚的制备与激活 | 第46页 |
| 3.4 重构胚的移植 | 第46页 |
| 3.5 Nramp1转基因受体母羊妊娠检查 | 第46页 |
| 3.6 体细胞克隆结果的定位整合检测 | 第46-48页 |
| 3.6.1 对剖腹取出的胎儿进行定位整合检测 | 第46-47页 |
| 3.6.2 体细胞克隆新生小羊的定位整合鉴定 | 第47-48页 |
| 4 结果 | 第48-55页 |
| 4.1 体细胞克隆情况 | 第48-50页 |
| 4.2 受体母羊的妊娠检查 | 第50页 |
| 4.3 剖腹所取胎儿的定位整合检测 | 第50-52页 |
| 4.3.1 胎儿成纤维细胞的分离培养 | 第50-51页 |
| 4.3.2 胎儿成纤维细胞定位整合PCR检测 | 第51-52页 |
| 4.4 新生小羊的定位整合鉴定 | 第52-54页 |
| 4.4.1 新生小羊血液基因组PCR检测 | 第52-54页 |
| 4.4.2 新生小羊血液基因组的测序 | 第54页 |
| 4.5 新生小羊的体检 | 第54-55页 |
| 5 讨论 | 第55-58页 |
| 5.1 同步发情的控制问题 | 第55页 |
| 5.2 体细胞克隆流程精简 | 第55-56页 |
| 5.3 连续核移植方法可为制备无标记基因的转基因山羊提供便利 | 第56-58页 |
| 第四章 全文结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 附录Ⅰ 溶液配方 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第66-67页 |
