| 摘要 | 第10-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 符号与縮略语说明 | 第17-18页 |
| 前言 | 第18-19页 |
| 文献综述 | 第19-41页 |
| 第一章 农药污染与生物修复 | 第19-41页 |
| 1 环境中农药污染现状 | 第19-20页 |
| 2 生物修复 | 第20-21页 |
| 3 酰胺类农药的微生物降解 | 第21-26页 |
| 3.1 降解菌株的筛选 | 第21页 |
| 3.2 降解途径的研究 | 第21-22页 |
| 3.3 酰胺酶的研究 | 第22-26页 |
| 3.3.1 酰胺酶的分类 | 第23-25页 |
| 3.3.2 催化的生物转化反应 | 第25页 |
| 3.3.3 酰胺酶的催化机制 | 第25-26页 |
| 4 有机磷农药的微生物降解 | 第26-41页 |
| 4.1 降解菌株的筛选 | 第26-28页 |
| 4.2 降解途径的研究 | 第28-30页 |
| 4.3 有机磷降解酶的研究 | 第30-41页 |
| 4.3.1 降解有机磷农药的相关酶类 | 第30-32页 |
| 4.3.2 常见有机磷降解酶的结构与催化机制 | 第32-41页 |
| 实验部分 | 第41-133页 |
| 第一章 M1降解谱及其降解特性的研究 | 第41-51页 |
| 1 材料与方法 | 第41-43页 |
| 1.1 菌株 | 第41页 |
| 1.2 主要培养基 | 第41页 |
| 1.3 主要试剂 | 第41-42页 |
| 1.4 菌种制备 | 第42页 |
| 1.5 M-1对甲基对硫磷和甲基对氧磷降解实验 | 第42页 |
| 1.6 M-1对酰胺类除草剂的降解试验 | 第42页 |
| 1.7 粗酶液的制备 | 第42页 |
| 1.8 磷酸酯酶的检测及测定 | 第42-43页 |
| 1.9 酰胺酶活力测定 | 第43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-48页 |
| 2.1 M-1对甲基对硫磷和甲基对氧磷的降解 | 第43-45页 |
| 2.2 M-1磷酸酯酶活力的检测 | 第45-46页 |
| 2.3 M-1对丙烯酰胺的降解 | 第46-47页 |
| 2.4 M-1对其它酰胺类中间体的降解 | 第47页 |
| 2.5 酰胺酶活力分析 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48页 |
| 本章小结 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-51页 |
| 第二章 酰胺水解酶基因的克隆、表达以及酶的特性研究 | 第51-97页 |
| 第一节 酰胺水解酶基因(PAMH)的克隆 | 第52-64页 |
| 1 材料与方法 | 第52-56页 |
| 1.1 培养基和试剂 | 第52页 |
| 1.2 所用菌株和质粒 | 第52-53页 |
| 1.3 鸟枪法构建基因文库示意图(图2-1) | 第53页 |
| 1.4 一步法感受态细胞的制备与转化 | 第53页 |
| 1.5 菌体总DNA的提取 | 第53-54页 |
| 1.6 质粒DNA的小量提取 | 第54页 |
| 1.7 染色体总DNA的Sau3AI与BamHI分别酶切和片段回收 | 第54-55页 |
| 1.8 酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 | 第55页 |
| 1.9 阳性克隆子对敌稗降解的检测 | 第55页 |
| 1.10 序列测定 | 第55页 |
| 1.11 基因序列比较与分析 | 第55-56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-64页 |
| 2.1 菌株M-1染色体总DNA的提取和部分酶切 | 第56页 |
| 2.2 菌株M-1总DNA文库的构建 | 第56页 |
| 2.3 阳性克隆子的筛选 | 第56-58页 |
| 2.4 阳性克隆子pUC118-M1及其亚克隆pUC118-M1-1测序和ORF分析 | 第58-61页 |
| 2.5 pamh、ORF2、ORF3基因序列的比对分析 | 第61-62页 |
| 2.6 pamh启动子预测 | 第62页 |
| 2.7 PamH二级结构和三级结构预测 | 第62-64页 |
| 第二节 酰胺水解酶蛋白(PAMH)在E.COLIBL21(DE3)中表达和纯化 | 第64-78页 |
| 1 材料与方法 | 第64-71页 |
| 1.1 试剂和培养基 | 第64页 |
| 1.2 菌株和质粒 | 第64页 |
| 1.3 大肠杆菌一步法感受态细胞的制备与转化 | 第64页 |
| 1.4 质粒DNA的小量提取 | 第64页 |
| 1.5 酰胺水解酶基因pamh的PCR扩增 | 第64-65页 |
| 1.6 pET29a-pamh表达载体的构建 | 第65-66页 |
| 1.7 酶切产物的纯化、酶连、转化与筛选 | 第66页 |
| 1.8 酰胺水解酶表达菌株构建 | 第66-67页 |
| 1.9 酰胺水解酶的表达及表达条件优化 | 第67页 |
| 1.10 PamH蛋白的纯化 | 第67-70页 |
| 1.10.1 硫酸铵分级沉淀 | 第67页 |
| 1.10.2 DEAE-Sephadex阴离子交换柱 | 第67-68页 |
| 1.10.3 DEAE-Cellulose色谱柱 | 第68-69页 |
| 1.10.4 葡聚糖凝胶层析法分离纯化蛋白质 | 第69-70页 |
| 1.11 酰胺水解酶PamH酶活检测 | 第70页 |
| 1.12 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第70-71页 |
| 1.12.1 样品的处理 | 第70-71页 |
| 1.12.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第71页 |
| 1.12.3 蛋白胶的染色脱色 | 第71页 |
| 1.13 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 | 第71页 |
| 2 结果与分析 | 第71-78页 |
| 2.1 pET29a-pamh载体构建 | 第71-72页 |
| 2.2 PamH在大肠杆菌中表达条件的优化 | 第72-76页 |
| 2.2.1 不同培养基中PamH表达的活力 | 第73-74页 |
| 2.2.2 不同起始OD_(600)诱导PamH表达的活力 | 第74页 |
| 2.2.3 不同温度诱导PamH表达的活力 | 第74-75页 |
| 2.2.4 不同IPTG浓度诱导PamH表达的活力 | 第75-76页 |
| 2.3 酰胺水解酶PamH的纯化 | 第76-78页 |
| 第三节 酰胺水解酶(PAMH)酶学特性研究 | 第78-97页 |
| 1 材料与方法 | 第78-83页 |
| 1.1 材料 | 第78页 |
| 1.2 PamH的制备和纯化 | 第78页 |
| 1.3 酰胺水解酶PamH的酶活测定 | 第78-80页 |
| 1.3.1 酶反应体系 | 第78页 |
| 1.3.2 尿素和伯胺类酰胺化合物水解产物氨的测定 | 第78页 |
| 1.3.3 其它酰胺类化合物的测定 | 第78页 |
| 1.3.4 酰基转移酶活力测定 | 第78-80页 |
| 1.4 PamH动力学参数的测定 | 第80页 |
| 1.5 等电点pI的测定 | 第80页 |
| 1.6 酶的最适反应温度与热稳定性 | 第80页 |
| 1.7 酶的最适反应pH值与酸碱稳定性 | 第80-81页 |
| 1.8 金属离子和化学试剂对酶活力的影响 | 第81页 |
| 1.9 定点突变引物设计 | 第81-82页 |
| 1.10 定点突变重组酶PamH的表达纯化 | 第82页 |
| 1.11 突变重组酶酶活力检测 | 第82-83页 |
| 2 结果与分析 | 第83-90页 |
| 2.1 酰胺水解酶对敌稗的反应进程曲线与酶浓度曲线 | 第83-84页 |
| 2.2 酶的热稳定性与最适反应温度 | 第84-85页 |
| 2.3 酶的酸碱稳定性与最适反应pH值 | 第85-86页 |
| 2.4 金属离子和化学试剂对酶活力的影响 | 第86-87页 |
| 2.5 酶的底物特异性与动力学参数研究 | 第87-89页 |
| 2.5.1 酰胺水解酶活力研究 | 第87-88页 |
| 2.5.2 PamH酰基转移酶活力研究 | 第88-89页 |
| 2.6 等电点pI测定 | 第89页 |
| 2.7 PamH突变体的活力 | 第89-90页 |
| 3 讨论 | 第90-93页 |
| 本章小结 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-97页 |
| 第三章 甲基对氧磷降解关键酶基因的克隆与表达 | 第97-113页 |
| 第一节 甲基对氧磷水解酶基因(MPDP)的克隆 | 第97-112页 |
| 1 材料与方法 | 第97-104页 |
| 1.1 培养基和试剂 | 第97-98页 |
| 1.2 菌株和质粒 | 第98-99页 |
| 1.3 鸟枪法构建Paracoccus versutus M-1基因文库示意图 | 第99页 |
| 1.4 一步法感受态细胞的制备与转化 | 第99页 |
| 1.5 菌株Paracoccus versutus M-1总DNA的提取 | 第99页 |
| 1.6 质粒DNA的小量提取 | 第99页 |
| 1.7 染色体总DNA的Sau3AI与BamHI分别酶切和片段回收 | 第99页 |
| 1.8 与pUC118载体酶连 | 第99页 |
| 1.9 酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 | 第99页 |
| 1.10 阳性克隆子插入片段测序 | 第99-100页 |
| 1.11 基因序列比较与分析 | 第100页 |
| 1.12 有机磷水解酶基因mpdp的PCR扩增 | 第100-101页 |
| 1.13 pET29a-mpdp表达载体的构建 | 第101页 |
| 1.14 有机磷水解酶的表达 | 第101-102页 |
| 1.15 Mpdp蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化 | 第102页 |
| 1.16 Ni-NTA树脂的预处理 | 第102页 |
| 1.17 葡聚糖凝胶层析法分离纯化蛋白质 | 第102-103页 |
| 1.18 甲基对氧磷水解酶酶活力单位的定义及酶活测定 | 第103-104页 |
| 1.18.1 酶活力单位定义 | 第103页 |
| 1.18.2 酶活测定原理 | 第103页 |
| 1.18.3 酶活测定步骤 | 第103-104页 |
| 1.18.4 酶活的计算方法 | 第104页 |
| 1.19 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第104页 |
| 2 结果与分析 | 第104-112页 |
| 2.1 菌株M-1总DNA部分酶切和文库的构建 | 第104-106页 |
| 2.2 阳性克隆子的筛选 | 第106页 |
| 2.3 阳性克隆子pUC118-Mp的测序和ORF分析 | 第106-108页 |
| 2.4 Mpdp二级结构和三级结构预测 | 第108-110页 |
| 2.5 pET29a-mpdp载体构建 | 第110页 |
| 2.6 甲基对氧磷水解酶Mpdp的纯化 | 第110-112页 |
| 第二节 甲基对氧磷水解酶酶学特性的研究 | 第112-113页 |
| 1 实验材料与方法 | 第112-113页 |
| 1.1 材料 | 第112页 |
| 1.2 重组蛋白酶液的制备和纯化 | 第112页 |
| 1.3 甲基对氧磷水解酶的酶活力测定 | 第112页 |
| 1.4 酶的最适反应温度与热稳定性 | 第112页 |
| 1.5 酶的最适反应pH值与酸碱稳定性 | 第112页 |
| 1.6 金属离子和化学试剂对酶活力的影响 | 第112-113页 |
| 1.7 Mpdp动力学参数的测定 | 第113页 |
| 1.8 等电点pI的测定 | 第113页 |
| 2 结果与分析 | 第113-133页 |
| 2.1 Mpdp的热稳定性与最适反应温度 | 第113-114页 |
| 2.2 Mpdp的酸碱稳定性与最适反应pH值 | 第114-115页 |
| 2.3 金属离子和化学试剂对酶活力的影响 | 第115-116页 |
| 2.4 酶的等电点 | 第116页 |
| 2.5 酶的底物特异性与动力学参数研究 | 第116-117页 |
| 第三节 MPDP酶的随机突变和功能研究 | 第117-126页 |
| 1 材料与方法 | 第117-121页 |
| 1.1 材料 | 第117页 |
| 1.2 质粒抽提 | 第117页 |
| 1.3 有机磷水解酶基因mp咖随机突变 | 第117-119页 |
| 1.4 序列测定与分析 | 第119-120页 |
| 1.5 定点突变引物设计 | 第120-121页 |
| 1.6 定点突变重组酶Mpdp的表达纯化 | 第121页 |
| 1.7 Mpdp酶活力测定方法 | 第121页 |
| 2 结果与分析 | 第121-126页 |
| 2.1 易错PCR条件摸索 | 第121-122页 |
| 2.2 随机突变法获得水解活力提高的酶突变体 | 第122-123页 |
| 2.3 突变体酶活力的比较 | 第123-124页 |
| 2.4 Mpdp酶的定点突变与功能研究 | 第124-126页 |
| 3 讨论 | 第126-128页 |
| 本章小结 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-133页 |
| 全文总结 | 第133-135页 |
| 本论文主要创新点 | 第135-137页 |
| 附录一 实验用培养基及分子生物学试剂 | 第137-141页 |
| 附录二 阳性克隆子测序结果 | 第141-147页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第147-149页 |
| 致谢 | 第149页 |
