| 目录 | 第3-7页 |
| 中文摘要 | 第7-12页 |
| 英文摘要 | 第12页 |
| 前言 | 第12-27页 |
| 一、RNA分子：基因调控中一种非常重要的调控因子 | 第12-16页 |
| 1 RNA分子：从遗传信息的传递者到调控功能的执行者 | 第12-14页 |
| 2 RNA分子作为调控因子比蛋白质有更多的优势 | 第14页 |
| 3 RNA分子在分化发育调控中的优势 | 第14-15页 |
| 4 RNA分子作为调控因子的最新进展 | 第15-16页 |
| 二、NATs在真核生物中具有重要的调控功能 | 第16-22页 |
| 1 NATs在真核生物中具有重要的调控作用 | 第17-18页 |
| 2 NATs介导调控的几种作用方式 | 第18-21页 |
| 2.1 转录干扰 | 第19-20页 |
| 2.2 RNA封闭 | 第20页 |
| 2.3 依赖dsRNA的机制及RNAi | 第20-21页 |
| 3 碱基配对是RNA介导调控的最重要的作用方式 | 第21-22页 |
| 三、NSATs的研究现状 | 第22-25页 |
| 1 研究手段主要是用生物信息学方法或microarray分析 | 第22-24页 |
| 2 鉴定出的NSATs远比预期的多 | 第24页 |
| 3 现有的研究对NSATs只有预测功能 | 第24-25页 |
| 四、高通量实证NSATs相互作用的必要性和迫切性 | 第25-26页 |
| 1 高通量实证NSATs相互作用的必要性 | 第25页 |
| 2 高通量实证NSATs相互作用的迫切性 | 第25-26页 |
| 五、本研究的主要内容 | 第26-27页 |
| 材料与方法 | 第27-47页 |
| 一、材料 | 第27-28页 |
| 1 实验用小鼠 | 第27页 |
| 2 菌株和质粒 | 第27页 |
| 3 限制性内切酶及其它修饰酶类 | 第27页 |
| 4 其它主要试剂及试剂盒 | 第27-28页 |
| 5 主要仪器 | 第28页 |
| 二、方法 | 第28-47页 |
| 1 基本技术路线 | 第28-30页 |
| 2 RNA的提取与RNaseⅠ酶解处理 | 第30-32页 |
| 2.1 小鼠胚胎的分离 | 第30页 |
| 2.2 小鼠胚胎总RNA的提取 | 第30-31页 |
| 2.3 总RNA的DNaseⅠ处理 | 第31页 |
| 2.4 总RNA的RNaseⅠ处理 | 第31-32页 |
| 3 dsRNA的可靠性分析 | 第32-34页 |
| 3.1 基本策略 | 第32页 |
| 3.2 用RNaseⅠ酶解总RNA | 第32-33页 |
| 3.3 用RNaseⅢ酶解总RNA | 第33页 |
| 3.4 用RNaseⅠ和RNaseⅢ酶解总RNA | 第33页 |
| 3.5 甲醛琼脂糖凝胶电泳 | 第33-34页 |
| 4 dsRNA的内源性分析 | 第34-37页 |
| 4.1 基本策略 | 第34-35页 |
| 4.2 用体外转录法获得两条互补的单链RNA分子 | 第35-36页 |
| 4.3 单链RNA分子的纯化 | 第36页 |
| 4.4 两条单链RNA分子经过变性、缓慢退火处理 | 第36页 |
| 4.5 两条单链RNA分子在室温温育 | 第36页 |
| 4.6 RNA混合物的提取 | 第36-37页 |
| 4.7 RNA混合物用RNaseⅠ酶解 | 第37页 |
| 5 NSATs的cDNA文库的构建(定向克隆) | 第37-43页 |
| 5.1 逆转录反应获得cDNA的第一条链 | 第37-38页 |
| 5.2 cDNA的第一条链加多聚A | 第38页 |
| 5.3 cDNA的第二条链的合成 | 第38-39页 |
| 5.4 dsDNA的分级分离 | 第39页 |
| 5.5 dsDNA平末端的制备 | 第39-40页 |
| 5.5 dsDNA粘末端的制备 | 第40页 |
| 5.7 克隆载体的制备 | 第40-42页 |
| 5.7.1 EcoRⅤ酶切反应 | 第41页 |
| 5.7.2 DNA片段回收 | 第41页 |
| 5.7.3 SalⅠ酶切反应 | 第41-42页 |
| 5.8 连接反应 | 第42页 |
| 5.9 感受态E.coli DH5α细胞制备 | 第42页 |
| 5.10 感受态细胞的转化 | 第42-43页 |
| 5.11 质粒DNA的小量制备 | 第43页 |
| 5.12 重组子的酶切鉴定 | 第43页 |
| 5.13 cDNA文库完整性的分析 | 第43页 |
| 6 克隆测序 | 第43-44页 |
| 7 序列数据分析 | 第44-47页 |
| 7.1 数据库来源 | 第44页 |
| 7.1.1 cDNAs数据库 | 第44页 |
| 7.1.2 EST数据库 | 第44页 |
| 7.1.3 小鼠基因组数据库 | 第44页 |
| 7.1.4 人基因组数据库 | 第44页 |
| 7.2 NSATs的染色体定位 | 第44-45页 |
| 7.3 基因组位点转录状态分析 | 第45页 |
| 7.4 基因组位点基因分布分析 | 第45页 |
| 7.5 基因组位点转录方向分析 | 第45页 |
| 7.6 基因组匹配位点多拷贝分析 | 第45页 |
| 7.7 NSATs相关基因的编码蛋白功能分析 | 第45-46页 |
| 7.7.1 BLASTX分析 | 第45-46页 |
| 7.7.2 ORF分析 | 第46页 |
| 7.7.3 GENSCAN分析 | 第46页 |
| 7.8 NSATs相关基因已知功能分析 | 第46页 |
| 7.9 顺式NSATs重叠模式分析 | 第46页 |
| 7.10 序列分析小结 | 第46-47页 |
| 实验结果 | 第47-68页 |
| 一、RNaseⅠ酶解中,约16％的总RNA分子受到保护 | 第47-49页 |
| 1 总RNA的质量分析 | 第47页 |
| 2 总RNA的RNaseⅠ酶解分析 | 第47-48页 |
| 3 总RNA在RNaseⅠ处理前后的定量分析 | 第48-49页 |
| 二、RNaseⅠ酶解剩下的RNA是dsRNA | 第49-50页 |
| 1 RNaseⅠ对总RNA不同酶切时间结果比较 | 第49-50页 |
| 2 RNaseⅢ对总RNA酶切结果分析 | 第50页 |
| 3 RNaseⅠ和RNaseⅢ共同酶切总RNA结果分析 | 第50页 |
| 三、dsRNA不是在体外形成的 | 第50-51页 |
| 四、NSATs的cDNA文库的构建(定向克隆) | 第51-53页 |
| 1 cDNA第一条链的合成,加A及第二条链的合成 | 第51-52页 |
| 2 cDNA加A、第二条链的合成 | 第52页 |
| 3 dsDNA重组体的构建和克隆效率的分析 | 第52-53页 |
| 4 cDNA文库完整性的分析 | 第53页 |
| 5 克隆测序 | 第53页 |
| 五、序列数据分析结果 | 第53-68页 |
| 1 NSATs的染色体定位 | 第54-55页 |
| 2 序列对应的基因组位点大部分有转录产物 | 第55-57页 |
| 3 大部分可以转录的基因组位点编码基因 | 第57-58页 |
| 4 大部分可以转录的基因组位点有双向转录产物 | 第58-60页 |
| 5 部分序列在基因组有多拷贝匹配位点 | 第60-61页 |
| 6 NSATs相关基因的编码蛋白功能分析 | 第61-64页 |
| 7 大部分NSATs相关基因是细胞分化或胚胎发育相关基因 | 第64-66页 |
| 8 顺式NSATs重叠模式分析 | 第66-67页 |
| 9 序列分析小结 | 第67-68页 |
| 讨论 | 第68-77页 |
| 一、RNaseⅠ保护法高通量筛选NSATs的可靠性 | 第68-70页 |
| 1 对RNaseⅠ耐受的RNA是dsRNA | 第68-69页 |
| 2 总RNA被体外RNaseⅠ降解后剩下的dsRNA是内源性 | 第69页 |
| 3 对克隆序列的分析进一步证实了策略的可靠性 | 第69-70页 |
| 二、RNaseⅠ保护法大规模筛选NSATs的先进性 | 第70-71页 |
| 三、RNaseⅠ酶解鉴定NSATs的优越性 | 第71页 |
| 1 方法上的简便性 | 第71页 |
| 2 信息上的高通量性 | 第71页 |
| 四、实验策略 | 第71-74页 |
| 1 cDNA文库构建的策略 | 第71-73页 |
| 1.1 第二条链的合成 | 第71-72页 |
| 1.2 粘末端的选择 | 第72页 |
| 1.3 载体的选择 | 第72-73页 |
| 2 数据库 | 第73-74页 |
| 五、Sense-Anti-sense RNAs相互作用的普遍性 | 第74-75页 |
| 1 相互作用的复杂性 | 第74页 |
| 2 配对方式上的多样性 | 第74页 |
| 3 功能上的全面性 | 第74-75页 |
| 六、本研究为理解已知基因尤其是胚胎发育相关基因的调控提供了新的途径 | 第75页 |
| 七、本研究的不足及展望 | 第75-77页 |
| 小结 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-82页 |
| 附录1 文献综述 | 第82-90页 |
| 附录2 部分NSATs测序图 | 第90-96页 |
| 附录3 英文名词及缩写 | 第96-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 个人简历 | 第98页 |
